甲基丁香酚(Methyleugenol, ME)是一种天然存在于多种草本植物及香料中的苯丙素类化合物，具有肝毒性。经饮食暴露后，ME在肝脏中经历代谢活化，形成DNA加合物并导致肝损伤。尽管ME被列为可疑人类肝癌致癌物，但其诱导的DNA加合物由何种DNA修复通路清除尚不清楚。研究人员利用多种基因工程细胞模型，研究了核苷酸切除修复(Nucleotide Excision Repair, NER)在该过程中的作用。数据表明，转录偶联(TC)-NER而非全基因组(GG)-NER在其中发挥关键作用，揭示ME诱导的DNA损伤会引发有害的转录应激。机制上，ME衍生的DNA加合物阻滞RNA聚合酶II(RNAPII)，导致其活性亚基RPB1从染色质释放并输出至细胞质，随后经蛋白酶体降解以促进修复和转录恢复。ME衍生的DNA损伤阻滞RNAPII会促进CSB滞留，并招募CSA和UVSSA。触发的经典TC-NER通路清除了ME诱导的DNA损伤，维持了基因组完整性并促进细胞存活。在高DNA加合物水平或TC-NER缺陷的细胞中，持续的转录应激会引发基因组不稳定性，诱导凋亡性细胞死亡，并显著降低长期细胞存活率。相比之下，GG-NER受损的细胞并未对ME引发的细胞毒性表现出增敏。综上所述，经典TC-NER通路对于清除ME及其可能还包括结构相关苯丙素类化合物诱导的DNA加合物至关重要。这些发现对患有TC-NER缺陷的柯凯因氏综合征(Cockayne syndrome, CS)患者尤为重要。
该研究聚焦于食品污染物甲基丁香酚(Methyleugenol, ME)的肝毒性机制及DNA修复响应。ME广泛存在于罗勒、龙蒿等香料中，经细胞色素P450 1A2(CYP1A2)代谢活化生成1'-羟基甲基丁香酚(OH-ME)，再经磺基转移酶(SULT1A1/1C2)作用形成亲电中间体，攻击DNA碱基产生N2 -(反式-甲基异丁香酚-3'-基)-2'-脱氧鸟苷(N2 -MIE-dG)和N6 -(反式-甲基异丁香酚-3'-基)-2'-脱氧腺苷(N6 -MIE-dA)两种主要加合物。国际癌症研究机构(IARC)将其列为2A类可能人类致癌物，但负责修复此类加合物的具体通路尚未明确。鉴于其化学结构特征暗示核苷酸切除修复(NER)可能参与其中，且前期研究表明其结构类似物黄樟素(ES)的加合物在NER缺陷细胞中积累，研究人员旨在阐明NER在ME致DNA损伤修复中的作用及其对基因组稳定性和细胞命运的影响，这对于评估人群健康风险及指导柯凯因氏综合征(CS)患者的饮食防护具有重要意义。
研究人员采用了多种关键技术方法：利用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)结合稳定同位素稀释法定量分析DNA加合物水平；通过siRNA敲低和小鼠基因敲除模型构建NER缺陷细胞（包括XPA、CSA、CSB、UVSSA、DDB2缺陷型），并结合原发性小鼠肝细胞(PMH)验证表型；应用蛋白质印迹法(Western Blot)检测DNA损伤应答(DDR)、细胞凋亡及修复蛋白动态变化；采用5-乙炔基尿苷(EU)掺入实验结合共聚焦显微镜评估新生RNA合成以监测转录活性；利用荧光漂白恢复(FRAP)技术分析CSB蛋白在染色质上的滞留动力学；通过免疫荧光染色检测R-环(R-loop)形成；并运用流式细胞术和微核试验评估染色体不稳定性。
研究结果如下：
OH-ME触发DNA加合物的形成与持续存在 ：研究人员在HepG2细胞中观察到，经OH-ME处理后，N2 -MIE-dG和N6 -MIE-dA加合物随时间依赖性积累。撤药恢复期实验显示，两种加合物仅被部分修复（24小时内减少35-48%），且在72小时的观察期内持续存在，表明ME诱导的DNA损伤难以被细胞完全清除。
XPA对OH-ME诱导的DNA损伤应答和细胞毒性的影响 ：敲低必需NER因子XPA或使用XPA基因敲除小鼠的原代肝细胞(PMH)进行实验。结果显示，在XPA缺陷细胞中，OH-ME处理显著增强了γH2AX、pCHK2等DNA损伤标志物及p53、cleaved caspase-3等凋亡标志物的表达，并伴随Annexin V阳性细胞比例大幅增加和细胞活力显著下降，证实NER通路参与了ME加合物的清除。
GG-NER与TC-NER在清除ME衍生DNA加合物中的相关性 ：利用DDB2（GG-NER缺陷）和CSA（TC-NER缺陷）的HeLa同基因细胞系进行研究。结果表明，CSA缺陷细胞对OH-ME高度敏感，DNA加合物水平显著高于野生型细胞且持续上升，而DDB2缺陷细胞与野生型敏感性相似。这证明TC-NER而非GG-NER负责清除ME诱导的DNA损伤。
TC-NER缺陷对OH-ME触发细胞毒性的影响 ：在HeLa和HCT116细胞模型中进一步证实，CSA或CSB（TC-NER关键因子）的缺失导致细胞对OH-ME诱导的凋亡和坏死极度敏感，细胞活力急剧下降，且这种敏感性具有TC-NER特异性，与依托泊苷（转录非依赖型药物）的作用模式不同。
OH-ME触发的转录应激及CSA的作用 ：EU掺入实验显示OH-ME剂量依赖性地抑制新生RNA合成。机制上，OH-ME导致RNAPII的催化亚基RPB1及其磷酸化形式(pRPB1)从染色质解离，发生核质转位并被输出至细胞质，该过程可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，表明阻滞的RNAPII经历了蛋白酶体介导的降解以解除转录封锁。
ME衍生DNA加合物激活经典TC-NER通路以恢复转录 ：FRAP实验显示，OH-ME处理导致CSB蛋白在染色质上滞留，且在CSA或XPA缺陷细胞中滞留进一步增强，而在XPC敲低细胞中无此现象，再次确证TC-NER的特异性激活。同时，UVSSA通过USP7去泛素化酶保护CSB免于降解，这是TC-NER进程的关键调控环节。随着修复进行，RNA合成能力和染色质结合的RPB1水平在恢复期逐渐回升。
OH-ME触发的R-环形成与染色体不稳定性 ：研究发现OH-ME处理导致细胞内R-环（DNA:RNA杂合链）水平显著升高，并在细胞分裂中诱发微核(Micronuclei, MN)形成。这种基因组不稳定性在TC-NER缺陷的CSA–/– 细胞中更为剧烈，表明TC-NER功能缺失加剧了由转录应激导致的基因组损伤。
在讨论部分，研究人员指出，ME加合物（特别是N2 -MIE-dG）由于对DNA双螺旋扭曲较小，难以被GG-NER识别，因此主要依赖TC-NER进行修复。这一机制与苯并芘(BaP)等环境致癌物诱导的某些N2 -dG加合物的修复特性相似。研究首次明确了TC-NER在抵御膳食性苯丙素类化合物肝毒性中的核心地位。特别值得注意的是，临床数据显示多数柯凯因氏综合征(CS)患者伴有肝功能异常，本研究提示这可能与CS患者因TC-NER缺陷而无法有效清除日常饮食中摄入的ME等化合物导致的肝损伤有关。此外，研究还揭示了转录阻滞引发的R-环积累是连接DNA损伤与染色体不稳定性（微核形成）的重要桥梁。综上所述，该研究确立了TC-NER是清除ME诱导DNA加合物的关键通路，对于理解CS等早衰症患者的病理机制及制定饮食干预策略具有重要的转化医学价值。论文发表于《Cell Death & Disease》。
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