猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪严重的肠道疾病，并对全球养猪业构成重大的经济威胁。尽管已有疫苗可用，但针对PEDV的有效抗病毒策略仍然有限。羟氯喹（HCQ）是一种溶酶体亲和性药剂，据报道具有抗病毒和免疫调节特性；然而，其对PEDV感染的影响尚未完全阐明。在本研究中，研究人员评估了HCQ对PEDV的体外抗病毒活性，并检查了其对该病毒生命周期不同阶段及宿主炎症信号传导的影响。HCQ显著降低了PEDV复制、病毒蛋白表达和感染性病毒的产生，这通过RT–qPCR、Western blotting、免疫荧光分析和空斑试验得到证明。加药时间实验显示，HCQ对病毒附着的影响极小，但能有效抑制病毒内化、复制和释放。此外，HCQ显著抑制了PEDV诱导的促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）的表达，并减弱了核因子κB（NF-κB）信号通路的激活。总之，这些发现表明HCQ在体外对PEDV感染发挥双重抗病毒和抗炎作用，突出了其作为靶向宿主的抗病毒策略的潜力。
本研究由Yu-Wei Zheng、Cai-Yu Chen、Chia-Yu Chang、Chienjin Huang、Hui-Wen Chang及Min-Yuan Chia（国立中兴大学兽医学院兽医系，台湾台中）共同完成，发表于《Microbial Pathogenesis》。猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于α冠状病毒属（Alphacoronavirus），为有包膜的阳性单股RNA病毒，可致仔猪急性水样腹泻、脱水及高死亡率，造成全球养猪业重大经济损失。尽管已实施疫苗接种策略，但因病毒遗传变异及保护性免疫不完全，PEDV仍反复暴发，因此亟需有效的抗病毒策略。PEDV进入和复制与宿主内吞途径及细胞内膜动力学密切相关，其刺突蛋白（PEDV-S）介导病毒附着和膜融合，核衣壳蛋白（PEDV-N）参与RNA封装、复制及 intracellular trafficking；同时PEDV感染会通过激活核因子κB（NF-κB）信号通路诱导强烈的宿主炎症反应，过量炎症与肠道上皮损伤及疾病严重程度相关。羟氯喹（HCQ）是氯喹的羟基化衍生物，为溶酶体亲和性药剂，可通过升高酸性细胞器（如内体、溶酶体）内pH值损害pH依赖性病毒进入过程，并可抑制NF-κB激活、减少促炎细胞因子产生，已被广泛研究作为靶向宿主的抗病毒剂对抗包括冠状病毒在内的多种病原体，但其对PEDV的抗病毒活性、对PEDV生命周期各阶段的影响及对PEDV诱导的炎症信号的作用尚未明确，此前仅有的相关研究缺乏对其阶段特异性抗病毒作用和免疫调节特性的系统表征，因此研究人员开展了本项体外研究。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：使用Vero细胞及台湾分离的PEDV Pintung 52株（适应于Vero细胞），通过CCK-8法评估HCQ的细胞毒性；通过RT–qPCR检测病毒RNA及炎症、NF-κB通路相关基因mRNA水平，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用2−ΔΔCt法计算相对表达量；通过Western blotting检测PEDV-N及GAPDH蛋白表达；通过空斑试验测定培养上清中的感染性病毒滴度（空斑形成单位/毫升，PFU/mL）；通过免疫荧光分析（IFA）观察PEDV-N、PEDV-S及p65蛋白的定位；通过时间加药（time-of-addition）实验分别评估HCQ对病毒附着、内化、复制及释放阶段的作用。
3.1. HCQ在Vero细胞中的细胞毒性
研究人员通过CCK-8实验评估了不同浓度HCQ处理24小时和48小时对Vero细胞活力的影响，结果显示24小时处理时，≤25 μg/mL的HCQ浓度对细胞活力无显著影响，50 μg/mL及以上浓度则显著降低细胞活力（p < 0.05），48小时处理时细胞毒性更明显，因此后续抗病毒实验选用≤25 μg/mL的无细胞毒性浓度。
3.2. HCQ在Vero细胞中的抗病毒活性
研究人员通过RT–qPCR、Western blotting、空斑试验及免疫荧光分析评估HCQ的抗病毒效果，结果显示PEDV感染可导致PEDV-N基因表达随时间进行性增加，而HCQ处理在所有检测时间点均显著降低PEDV RNA水平（p < 0.001）；Western blotting显示HCQ以浓度依赖性方式降低PEDV-N蛋白表达，阳性对照利巴韦林（25 μg/mL）也可降低PEDV-N表达，且同浓度下HCQ的抗病毒活性强于利巴韦林；空斑试验显示HCQ以浓度依赖性方式减少空斑数量；免疫荧光分析显示HCQ处理可显著减弱PEDV-N及PEDV-S的绿色荧光信号，表明HCQ可有效抑制体外PEDV感染。
3.3. HCQ阻断PEDV的内化、复制和释放
研究人员通过时间加药实验评估HCQ对PEDV生命周期各阶段的作用，结果显示在病毒附着阶段（4°C共孵育HCQ与PEDV，随后37°C培养），HCQ对PEDV-N基因及蛋白表达无显著影响，表明HCQ不干扰病毒对宿主细胞的附着；在病毒内化阶段（4°C先让PEDV附着，随后加HCQ并于37°C培养2小时允许内化），HCQ以剂量依赖性方式显著降低PEDV RNA及蛋白水平；在病毒复制阶段（PEDV感染6小时后再加HCQ），HCQ同样显著抑制PEDV-N基因及蛋白表达；在病毒释放阶段（感染后12小时加HCQ，收集18小时上清做空斑试验），HCQ以浓度依赖性方式显著减少空斑形成，表明HCQ主要通过抑制病毒内化、复制和释放发挥抗PEDV作用，对病毒附着无显著影响。
3.4. HCQ减弱PEDV诱导的促炎细胞因子表达
研究人员通过RT–qPCR检测18和24小时感染后促炎细胞因子mRNA水平，结果显示PEDV感染显著上调IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达，而HCQ（25 μg/mL）处理可显著抑制这些细胞因子的诱导表达，且单独HCQ处理不影响未感染细胞的基线细胞因子表达，表明HCQ可有效抑制PEDV诱导的促炎细胞因子反应。
3.5. HCQ减弱Vero细胞中PEDV诱导的NF-κB激活
研究人员通过RT–qPCR检测NF-κB通路相关基因（IκBα、NF-κB）的mRNA水平，并通过免疫荧光分析p65的核转位情况，结果显示PEDV感染显著上调IκBα和NF-κB的mRNA表达（24小时更明显），HCQ处理可显著抑制这种诱导，单独HCQ不影响基线表达；免疫荧光分析显示TNF-α刺激和PEDV感染均可诱导p65的核定位（NF-κB激活的标志），而HCQ处理可减少p65的核积累，p65主要保留在细胞质中，表明HCQ可在转录和蛋白定位水平抑制PEDV诱导的NF-κB信号通路激活。
在讨论部分，研究人员指出本研究表明HCQ在体外通过靶向病毒生命周期多个阶段及抑制病毒诱导的炎症反应发挥抗PEDV作用，有效抗病毒浓度范围内HCQ对Vero细胞毒性低，与既往报道的HCQ在上皮及肾来源细胞系中微摩尔浓度下毒性极低的结果一致。时间加药实验表明HCQ不干扰病毒初始受体结合，但可抑制内化，这与冠状病毒需内体酸化以高效膜融合和进入的报道一致，HCQ通过升高内体pH值破坏PEDV进入；此外HCQ在病毒内化后给药仍可抑制复制，可能与冠状病毒在宿主膜衍生的特殊胞内膜区室复制、HCQ干扰胞内囊泡运输损害病毒复制区室形成有关，同时HCQ也可影响病毒组装和释放等晚期阶段。HCQ还可显著抑制PEDV诱导的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子表达，且不改变未感染细胞的基线表达；机制上HCQ可抑制NF-κB通路关键组分（NF-κB及调控抑制因子IκBα）的转录激活，免疫荧光证实HCQ可减少p65核转位，与既往临床及研究中HCQ降低炎症因子水平、抑制NF-κB激活的结果一致，HCQ对NF-κB上游信号的抑制可协调减弱炎症信号，有助于减少病毒复制及PEDV诱导的炎症反应。既往研究显示HCQ可抑制SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV等多种冠状病毒的体外感染，机制涉及干扰内体酸化及病毒进入，支持本研究的发现。HCQ的双重抗病毒和抗炎特性具有重要价值，因为过度炎症在PEDV相关肠损伤中起关键作用，靶向宿主、同时限制病毒复制和病理炎症的策略可能比仅直接作用的抗病毒药更具治疗优势，且本研究中HCQ单独处理不改变宿主基因表达，表明测试浓度下安全性良好。本研究也存在局限性：仅在缺乏完全功能性I型干扰素系统的Vero细胞中进行，需在猪肠上皮细胞或体内模型中验证；未来还需阐明HCQ干扰PEDV复制和释放的确切分子机制。结论为：HCQ通过靶向PEDV生命周期多个附着后阶段及抑制PEDV诱导的NF-κB介导的炎症反应，抑制PEDV感染，这些结果为了解HCQ抗PEDV的抗病毒潜力提供了新见解，支持进一步研究靶向宿主的抗病毒策略以防控PEDV感染。
