硝胺 [R(R′)N–NO2; R,R′=H 或烷基] 是有价值的合成产物，但目前对生成这些化合物的生物合成过程知之甚少。本研究旨在阐明由诺尔斯链霉菌（Streptomyces noursei）产生的硝胺类天然产物 N-硝基甘氨酸（NNG）的生物合成途径。稳定同位素示踪研究表明，补充了 l-(ε-15N) 赖氨酸、(15N) 甘氨酸或 (13C) 肼基乙酸（HAA）的 S. noursei 细胞分别将 67%、88% 和 67% 的同位素标记掺入到 NNG 中，表明这些化合物是 NNG 的生物合成前体。对 15N-Lys 标记的 NNG 进行的液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析证实，NNG 的硝基氮来源于赖氨酸。对 S. noursei 基因组的生物信息学分析显示，存在一个包含 HAA 生物合成机制（nngKLM）的生物合成基因簇（BGC），这与同位素标记结果一致。基因产物的体外重构成功产生了 HAA。通过将预测的 BGC 与先前发表的差异蛋白质组学数据进行交叉比对，确定了该 BGC 的边界。此外，研究还发现叠氮丝氨酸与 NNG 在 S. noursei 培养物中共同产生，通过一种假定的亚硝胺生物合成中间体将这两条生物合成途径联系起来。最后，NNG 形成二氧化碳（CO2）的氧平衡为−20.2%，与六氢 -1,3,5-三硝基 -1,3,5-三嗪（通用名：RDX；−21.6%）相当。NNG 的晶体结构数据表明，其以纯物质形式结晶而非水合物，表明其具有有利的含能结晶相。综合结果表明，该途径经进一步开发后，有望通过合成生物学或生物催化方法实现含能硝胺的可持续生产。
含能材料如六氢 -1,3,5-三硝基 -1,3,5-三嗪（RDX）、奥克托今（HMX）和六硝基六氮杂异伍兹烷（CL-20）在军事和航天领域至关重要，但其化学合成过程依赖腐蚀性试剂并产生大量 hazardous 废物，且反应剧烈、选择性差。利用酶或合成生物学方法进行生物制造有望解决上述环境与安全问题，因为酶促反应条件温和、具有高区域选择性且产物特异。然而，能够安装硝胺官能团的酶尚未被明确。N-硝基甘氨酸（NNG）是目前已知唯一由细菌产生的硝胺类天然产物，但其完整的生物合成途径此前尚未完全阐明。先前的研究提出了多种假设，包括直接硝化、亚硝酸盐依赖的亚硝化以及通过肼基乙酸（HAA）的氧化途径。为了解析 NNG 的生物合成机制并评估其作为含能材料的潜力，研究人员开展了系统性研究，相关成果发表于《Applied and Environmental Microbiology》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用稳定同位素（15N-Gly, 15N-Lys, 13C-HAA 等）喂养诺尔斯链霉菌（S. noursei ATCC 11455）培养物，结合液相色谱 - 飞行时间质谱（LC-TOF-MS）和串联质谱（LC-MS/MS）追踪同位素掺入情况及硝基氮来源；通过生物信息学工具 antiSMASH 预测生物合成基因簇（BGC），并结合先前的差异蛋白质组学数据界定基因簇边界；在大肠杆菌（E. coli）中异源表达并纯化相关酶蛋白（包括使用 BAP1 菌株表达含 4'-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的 NngM），进行体外多酶重构实验以验证 HAA 的合成；利用单晶 X 射线衍射（SC-XRD）解析 NNG 晶体结构，并结合热重分析 - 质谱联用（TGA-MS）技术评估其热稳定性和分解产物。
研究结果主要包含以下几个方面：
首先，关于 15N/13C 同位素标记与硝基氮来源，实验结果显示，补充 15N-甘氨酸和 13C-肼基乙酸（HAA）均能显著掺入 NNG，证实了甘氨酸和 HAA 的前体地位。关键的是，只有补充 l-(ε-15N) 赖氨酸时，NNG 的硝基氮部分才出现同位素位移，LC-MS/MS 碎片分析进一步确证硝基氮源自赖氨酸的ε-氨基，而非甘氨酸或精氨酸，从而支持了 Lys/HAA 依赖型生物合成途径。
其次，在 HAA 产生蛋白的纯化与表征方面，研究人员成功纯化了 NngL 和 NngM，并用来自诺卡氏菌的 NbtG 替代难以表达的 NngK。体外重构实验表明，NbtG、NngM 和 NngL 协同作用可将赖氨酸和甘氨酸转化为 HAA，直接证明了 S. noursei 具备合成 HAA 的酶学机制。
再次，关于 HAA 氧化生成 NNG 所需基因的预测，研究结合了 antiSMASH 预测与差异蛋白质组学数据，将 NNG 生物合成基因簇（BGC）的范围锁定在 19 个基因（nngA-nngS）内，其中 16 个基因在 NNG 产生期显著上调。分析发现该基因簇与叠氮丝氨酸生物合成基因簇高度相似。
最后，研究提出 NNG 与叠氮丝氨酸共享生物合成路径。S. noursei 培养物中同时检测到叠氮丝氨酸和 NNG，表明两者共用一个亚硝胺中间体（Ser-Gly-NNO）。研究人员推测，在 NngS（一种细胞色素 P450 酶）的作用下，该中间体被进一步氧化为硝胺结构的 Ser-NNG，进而水解为 NNG；若缺乏 NngS 的催化，中间体则非酶促转化为叠氮丝氨酸。此外，对 NNG 的物理化学性质分析显示，其氧平衡（-20.2%）与 RDX 相当，晶体结构显示其为无水纯物质，热分析表明其在受热时主要分解为氮气等小分子而不发生爆炸性自燃，显示出作为低敏感度含能材料的良好稳定性。
讨论部分总结指出，该研究阐明了 NNG 的生物合成途径，确认了赖氨酸、甘氨酸和 HAA 为其前体，且硝基氮源自赖氨酸。通过界定生物合成基因簇并发现其与叠氮丝氨酸途径的关联，揭示了硝胺形成的潜在酶学机制。NNG 的结构与热性质分析表明其具有作为含能材料的潜力。进一步开发该途径，利用其底物宽容性氧化非天然肼类化合物，或直接利用 S. noursei 生产 NNG，有望为含能硝胺的绿色可持续制造提供新策略，从而减少传统化学生产带来的环境污染。
