血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）是大脑的高度特化保护性边界，但其严重限制了治疗药物递送，为神经系统疾病与实体瘤的治疗带来重大挑战。聚焦超声（focused ultrasound, FUS）已成为一种非侵入性、瞬时开放BBB以实现局部药物与基因治疗递送的有力工具。FUS此前多与腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）等病毒载体联用，目前正被探索与聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒等非病毒载体结合，这类载体具备可调控的化学性质、可重复给药潜力及递送多样载荷的能力。在取得一系列积极进展的基础上，未来研究方向旨在提升安全性、靶向免疫调控，并整合诊断成像以实现治疗诊断（theranostic）潜力。总体而言，FUS与非病毒纳米载体技术的融合，代表了一种精准、微创且可及的中枢神经系统基因递送变革性策略。
血脑屏障带来的挑战
大脑是复杂且重要的器官，依赖多种特化保护机制抵御外源物质，其中最具代表性的即为血脑屏障。BBB是由内皮细胞通过紧密连接密封构成的多细胞神经血管网络，其内层为血管内皮，外层由周细胞与星形胶质细胞终足锚定于基底膜（图1A）。该屏障在血液与脑组织间形成物理阻隔，阻挡毒素、病原体及其他外源分子进入脑内；同时，BBB高表达ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白等外排转运体，可将已跨过屏障的底物泵回循环系统。尽管BBB对维持脑健康至关重要，但其会阻止98%的小分子（分子量<400 Da）通过。此外，脑内、肝脏与肺部的酶降解作用，以及脑类淋巴系统的治疗清除效应，进一步增加了治疗递送难度。这些物理与生化屏障使得多数脑部疾病的干预极为困难，包括帕金森病与阿尔茨海默病等当前最紧迫的临床难题。当针对这些难治性疾病的有前景的系统给药疗法在临床试验中失效时，BBB往往成为递送的限制性步骤。
以胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）为例，BBB在疾病进展与治疗结局中的作用尤为复杂且深远。随着GBM进展，BBB调控逐渐失调，快速血管生成破坏紧密连接，星形胶质细胞与周细胞排列紊乱，形成所谓的血-肿瘤屏障（blood-tumor barrier, BTB）。BTB呈异质性渗漏特征，其异常血管结构表现为基底膜崩解、周细胞与星形胶质细胞终足丢失及紧密连接破坏，导致血管通透性升高与组织间隙液压增高（图1B）。这种渗漏血管虽可被用于部分治疗药物的被动递送，但肿瘤内部递送异质性极强，仅有极低比例给药剂量可抵达靶点。此外，BTB中外排转运体的异质性与高表达进一步降低治疗递送效率，因为许多常规GBM治疗药物均为外排转运体底物（图1B）。值得注意的是，GBM中BBB破坏呈梯度分布：肿瘤核心区BBB破坏最严重，浸润边缘区血管渗漏程度逐渐降低，导致恶性组织治疗不均一，残留肿瘤细胞可继续增殖。综上，这些挑战亟需更先进的解决方案以提升治疗递送效率或减少系统给药剂量。
聚焦超声开放血脑屏障的物理机制
聚焦超声（FUS）是一种克服BTB与BBB实现靶向治疗递送的重要技术。FUS利用压电换能器将电能转换为振荡压力波，以压缩与稀疏交替的周期在组织内传播。多换能器单元经相位对齐后，相长干涉将声能聚焦于特定靶区，在提升局部声压幅值的同时保持能量沉积的空间局域性。焦域尺寸主要取决于超声频率、换能器几何形状及声波穿过颅骨的衰减特性：临床前高频系统焦域可达亚毫米级，而临床经颅系统通常产生毫米级焦域。这些经精确预测的压力波可与静脉注射的微泡（microbubbles, MBs）相互作用，非侵入性、可逆性地突破BBB（图2）。由于颅骨与脑实质等异质结构存在声阻抗失配，超声束在传播过程中会发生反射、折射与衰减，改变焦域波形时空特征，因此治疗需结合临床规划软件与磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）/声发射反馈，以确保靶区定位精度。近期机器学习与人工智能（artificial intelligence, AI）技术的发展，可通过计算机断层扫描（computed tomography, CT）或MRI数据预测声相位畸变并优化换能器相位校正，进一步提升焦域精度与治疗规划效率。为避免连续超声沉积导致的局部组织过热，用于BBB开放（BBB opening, BBBO）的FUS采用占空比低于1%的脉冲模式，最大限度减少热累积，确保其生物学效应为机械性且可逆。靶区的瞬时声场由波形压力、脉冲长度与频率共同决定，这些参数定义了机械指数、能量沉积以及与MBs的相互作用方式，最终介导BBBO。
当MBs随血液循环进入FUS焦域内的组织时，交变压力波使其发生膨胀与收缩，该行为可由经典气泡动力学模型描述。在中等峰负压下，MBs发生稳定空化，表现为对称振荡，在内皮附近产生剪切应力与微流，但不发生崩解（图2B）。这些机械力通过多种互补机制作用于BBB：变形并打开紧密连接、通过增加跨内皮通道增强囊泡运输、通过转胞吞作用提升囊泡运输效率，以及激活机械敏感通路，使BBB通透性在比无MBs时低三个数量级的压力下短暂升高。超声-MB相互作用还可刺激小窝介导的运输过程与内皮细胞内细胞骨架重塑，共同产生可逆的BBB通透性升高，通常在辐照后数小时内恢复。肿瘤与神经退行性疾病会改变这一范式：BTB的血管尺寸与通透性异质性会导致MBs在超声场中的动力学差异；阿尔茨海默病与帕金森病中，虽然血管直径可能保持不变，但受累脑区会出现脑血流总量改变与血管通透性升高，这些变化可能影响MBs相互作用及随后的血管渗透效应。
在更高压力下，MBs进入惯性空化区间，其崩解会产生冲击波与微射流，可能导致血管与实质结构不可逆损伤。MB自身的理化设计决定了其与驱动声场的耦合方式及机械能向生物渗透性的转化效率（图2C）。脂质壳MB弹性模量低、可压缩性高，可在适中压力下发生大幅可逆振荡；而聚合物壳或蛋白质壳MB的运动阻尼更强，共振频率向更高频段偏移。MB尺寸分布决定其共振频率与次谐波响应概率。研究表明，直径为1~8 μm的MBs中，较大MBs（>6 μm）所需声压低于1~2 μm MBs，但与4~5 μm MBs所需声压相当。除常规MB配方外，近期还开发了多种有效直径更大的工程化MBs，例如声簇疗法（acoustic cluster therapy, ACT）MBs，其在原位激活后有效直径可达约20~30 μm，可在较低声压下介导BBBO，且在空化效率与递送控制方面具有优势。大尺寸MBs介导的BBBO后，BBB恢复所需时间更长。因此，必须谨慎选择MB性质、浓度与超声参数，以实现安全、有效且可重复的FUS介导BBBO。
被动空化检测（passive cavitation detection, PCD）与功率空化成像（power cavitation imaging, PCI）可用于检测MB振荡释放的声谱信号。测得的声学特征包含原始FUS波的次谐波、超谐波或谐波（图2B），可反馈MB的工作状态；而宽带噪声则提示MB崩解与可能造成不良效应的强作用力。这些频谱特征构成了反馈控制辐照系统的基础，可动态调整压力输出以维持安全空化，确保能量供给足以维持稳定空化，同时抑制导致不可逆损伤的惯性空化。这种治疗监测方法对于脑肿瘤与神经退行性疾病FUS治疗的安全性监控与空化剂量保障至关重要。波形设计（脉冲长度、重复频率与振幅）、MB物理性质与空化物理之间的相互作用，共同决定了BBBO的安全与有效窗口，必须在治疗中精准调控以实现可预测、可重复的BBBO且无有害效应。
为何选择非病毒？为何是现在？
基因治疗（含病毒与非病毒策略）近期已在多种疾病领域取得临床成功。FDA已批准Hemgenix（用于B型血友病）与Luxturna（用于视网膜营养不良）等病毒载体疗法，以及Onpattro（用于淀粉样变性）与Spikevax（用于COVID-19）等非病毒载体疗法。基因治疗在癌症领域也稳步进展，包括头颈部癌的腺病毒载体疗法与白血病、淋巴瘤的CAR-T疗法均获临床成功。
FUS介导的BTB/BBB开放可为多类治疗药物递送带来获益，其中FUS与基因治疗的联用此前主要集中于AAV载体。AAV直径约20 nm，恰好处于FUS介导跨BBB递送的适宜尺寸范围。AAV的临床试验已广泛开展，FUS介导的AAV脑递送在非人灵长类动物中也已验证成功。然而，AAV存在明显局限性：尽管啮齿类动物AAV试验可行，但生产足够人体使用的AAV剂量成本极高；此外，由于机体对病毒产生获得性免疫应答，重复给予同一血清型AAV通常不可行，免疫抑制剂虽可部分降低AAV免疫原性，但在人体中效果有限。若仅为支持重复AAV给药而诱导全身性免疫抑制，将显著削弱旨在激活免疫系统以对抗疾病的基因治疗效果。
此前曾有观点认为，FUS介导的BBB开放难以对单个患者重复实施，主要受限于安全性担忧及昂贵设备与MRI引导的成本。但随着FUS治疗进入临床试验，单患者重复治疗已十分常见，且安全性良好。相关临床试验中最多可对单个患者实施6次重复FUS治疗，涵盖阿尔茨海默病与GBM等适应症：GBM患者中，BBBO联合紫杉醇或卡铂等化疗药物已显示出改善患者预后的效果。此外，虽然MRI在评估FUS治疗结局与脑反应方面仍具有重要价值，但新型低成本超声引导（ultrasound-guided, USgFUS）设备的发展，为重复给药策略提供了更经济的规划与靶向方案。总体而言，FUS治疗成本预计将持续下降，这使其与表达持续时间较短、往往需要重复给药的非病毒递送策略的适配性在未来将显著提升。
非病毒递送系统
研究人员认为，开发可有效协同FUS BBBO的非病毒平台将产生显著的转化影响。已有多项研究证实，FUS可将非病毒基因纳米载体与裸质粒DNA递送至BBB并跨越BBB。这类纳米载体具有可调的表面化学性质与尺寸，且免疫原性通常低于AAV（图3A）。尽管病毒载体的基因表达水平可比非病毒纳米颗粒（nanoparticles, NPs）高至少一个数量级，但非病毒系统在设计与载荷容量方面更具灵活性。病毒递送无法在空间上限制转基因在脑内的表达，给药后会导致广泛基因转导，且因载体免疫原性通常仅能单次给药；相比之下，FUS可将NPs递送局域化至特定脑区，并可重复实施，实现可控的区域特异性基因递送。
除跨越BBB外，NPs在脑实质中的高效传输是另一重障碍：脑实质带强负电荷、分子网络致密，会限制宏观与纳米尺度颗粒的穿透。因此，多数治疗性NPs在渗出后仅局限于血管周围区域。NPs的尺寸、组成与表面电荷等理化性质强烈影响其穿透脑实质的能力。FUS可通过MB振荡产生的机械力暂时扰动组织，推动NPs深入脑实质、改善分散度，帮助克服递送屏障。
聚合物纳米颗粒
聚合物纳米颗粒可由可生物降解或不可生物降解聚合物制备，实现载药的可控释放。聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）是该基因递送平台常用的阳离子聚合物，其可通过稳定核酸、保护其免受核酸酶降解来实现高转染效率。PEI与核酸复合后形成“意大利面-肉丸样”聚复合物结构，PEI聚合物链缠绕并屏蔽核酸载荷。复合体递送后，阳离子聚合物NPs与带负电的磷脂细胞膜接触，触发网格蛋白或小窝介导的内吞，随后通过质子海绵效应实现内体逃逸（图3B）。目前，PEI基NPs已在膀胱癌与头颈部癌等多种临床试验中被探索为癌症治疗剂。但PEI虽能有效包封带负电的基因载荷，其强正电荷会导致系统给药后吸附蛋白质，触发免疫清除并可能产生细胞毒性。为此，研究人员开发了聚乙二醇化（PEGylated）聚合物NPs，通过引入聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）构建“隐形”纳米颗粒，减少调理素化、延长循环时间并降低免疫识别，从而提升NPs稳定性与递送效率。已有研究表明，PEG化NPs与FUS联用可显著提升转染效率，优于静脉输注或对流增强给药等传统方式。
虽然研究人员观察到FUS递送高密度PEG化PEI NPs穿过BBB时未出现不良反应，但PEI不可生物还原，仍是转化的瓶颈。生物可还原PEI与聚β氨基酯（poly(β-amino esters), PBAEs）可潜在克服这一局限，已有研究显示PBAE可用于FUS+MB介导的基因与mRNA跨BBB转染。但PBAE电荷密度较低、稳定性不如PEI，血清中溶胀可能降低其穿过FUS开放的BBB的传输效率。其他可生物降解聚合物材料，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA），已被开发为具有更好生物相容性的基因载体。PLGA在小分子药物递送中长期被证明安全有效，近期也被证实可用于核酸疗法递送。此外，FUS已被用于递送封装于PEG化PBAE NPs中的核酸，转染效率显著高于FUS介导的裸核酸递送或其他临床常用NP配方。PLGA NPs与FUS联用实现跨BBB递送也有坚实研究基础。这些发现共同表明，FUS BBBO与生物相容性NP基因递送的协同，未来有望实现颅内疾病的安全有效治疗。
脂质纳米颗粒（LNPs）
脂质纳米颗粒（lipid NPs, LNPs）是一类可克服AAV与聚合物NPs局限性的纳米载体，尤其适用于FUS靶向脑递送，且具有良好生物相容性。与聚合物NPs类似，LNPs的化学性质与尺寸可调控以优化FUS跨BBB递送（图3）。COVID mRNA疫苗广泛使用LNPs作为载体，已充分证明其有效性与良好安全性。近期研究探索了通过调控携带mRNA的LNP组成，可增强其对脑内皮细胞等特定细胞类型的转染，为精准调控异常细胞行为提供了独特平台。但此类策略缺乏FUS提供的空间靶向能力，而这对脑肿瘤等疾病的治疗至关重要，可避免损伤正常脑实质与血管。虽然NP表面修饰靶向基团可限制其向组织深部的穿透，但FUS诱导的MB振荡会产生机械力，暂时改善肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）：降低肿瘤组织间隙高压、上调细胞与细胞旁运输机制，共同推动NPs深入脑实质，扩大整体分布与转染范围。FUS已被用于将携带mRNA或反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）的LNPs递送至BBB。但FUS介导的核酸递送中，LNPs的应用仍不充分，尤其在脑肿瘤领域。现有研究已证实，FUS介导的脑内LNP递送可在多种临床相关FUS强度下提升局部转染效率，且不诱发持续神经炎症或组织损伤。这是未来极具潜力的研究方向。
LNPs的模块化特性源于其配方的关键组分。LNPs衍生于传统脂质体药物递送系统，在设计、制造、转染效率与耐受性方面不断优化。标准LNPs由四种脂质组成：磷脂、胆固醇、可电离脂质与PEG-脂质（图3B）。辅助脂质（如磷脂与胆固醇）对形成LNP外层至关重要，可支持储存与循环稳定性，并决定细胞内递送效率。可电离脂质可在pH低于其酸解离常数时质子化，实现高效核酸包封：在酸性条件（pH<6）下组装LNPs时，可电离脂质带正电，可通过静电作用结合带负电的核酸载荷并完成包封。当LNPs通过内吞进入细胞后，内体区室pH降至生理pH以下，可电离脂质头部再次质子化，促进其与内体膜带负电脂质的静电相互作用，介导LNP载荷的内体逃逸（图3B）。最后，PEG-脂质对决定LNPs的尺寸、单分散性、循环时间、体内分布与稳定性至关重要：其由亲水性PEG聚合物链与疏水性脂质尾部构成，可锚定在LNP表面形成空间位阻屏障，防止颗粒聚集与血清蛋白吸附。PEG-脂质在给药后会从LNP表面解离，解离特性由其脂质锚长度决定；解离后血清蛋白会吸附到暴露的LNP表面形成蛋白冠，通过与表达对应受体的细胞结合决定其生物分布特征。
纳米颗粒转化的挑战
尽管这些非病毒基因递送系统显示出治疗应用的巨大潜力，但临床转化仍面临挑战。系统给药后，NPs会被单核吞噬细胞系统快速识别并清除，富集于肝、脾等滤过器官，导致这些器官的脱靶转染成为主要局限。在某些场景中，外周转染可能反而有益，例如脾或肝免疫细胞转染可促进免疫激活，支持更系统、持久的治疗应答。
为减轻快速免疫清除，常规NP配方常引入PEG化脂质，以增强颗粒稳定性、降低免疫识别并延长体内循环时间。但抗PEG抗体的产生会加速NP清除并放大免疫反应，阻碍重复给药。近期，研究人员开始探索通过调控蛋白冠来调节NP生物分布：蛋白冠的组成受NP表面电荷与组成强烈影响，可改变其与循环蛋白及免疫细胞的相互作用。已有研究开发出可优先靶向肝、肺、脾、肾或淋巴结等特定器官、同时最小化非靶组织转染的NP配方。在FUS背景下，这类器官靶向NPs可用于策略性引导系统NP向缺乏治疗靶点的“汇”器官蓄积，而FUS介导的BBB/BTB开放可实现脑内局部递送与转染。
此外，聚合物与脂质NPs均受其化学性质的固有挑战。LNPs虽可实现高效载荷包封与良好生物相容性，但也可通过激活先天免疫通路引发炎症，导致细胞因子释放与免疫细胞活化。相比之下，聚合物NPs具有更高的稳定性、更大的载荷容量与设计灵活性，但如前所述，许多聚合物NPs采用PEI等阳离子聚合物制备，存在细胞毒性与长期组织滞留的问题。生物可还原阳离子聚合物可在细胞内还原条件下降解，在保持高递送效率的同时减轻细胞毒性。这些挑战凸显了NP配方与设计持续创新的必要性，以提升安全性与治疗效力。
未来创新与技术发展的机遇
针对转染效率局限的设计策略
非病毒基因递送领域的核心挑战之一是实现足够高的转染效率与空间转染分布，以产生治疗结局，这在GBM等复杂组织微环境中尤为艰巨。但通过谨慎选择治疗载荷，即使部分转染也可启动强大的治疗应答。例如，细胞因子与趋化因子既可招募免疫细胞至肿瘤，又可将免疫抑制性TME重编程为促炎、抗肿瘤状态，将治疗效应扩展至初始转染群体之外。基于此，FUS可用于递送编码免疫刺激分子的非病毒基因载体，不仅可招募免疫效应细胞，还可使肿瘤对化疗、放疗、检查点抑制剂或过继性T细胞治疗等额外疗法增敏。此外，CRISPR等基因编辑策略即使无需完全转染也可生效，因为转染细胞中永久性的基因修饰可持久改变组织动力学：敲除免疫抑制基因或敲入免疫刺激基因同样可扰乱TME、促进免疫细胞招募，并使肿瘤对其他疗法增敏。因此，利用TME重编程的非病毒基因递送策略极具吸引力，其无需均匀转染即可实现有意义的抗肿瘤活性。FUS的非侵入性特点还可支持重复给药，进一步提升治疗应答。
过继性T细胞治疗
FUS介导的基因递送在TME重编程中的潜力，还体现在其与过继性T细胞治疗的协同前景中。CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中的临床成功，以及近期肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）与T细胞受体T细胞疗法（T cell receptor T-cell therapy, TCR-T）获批用于实体瘤，均支持神经肿瘤领域T细胞疗法的开发。尽管工程化T细胞在选择性识别与杀伤肿瘤细胞方面已取得显著进展，但其在脑肿瘤中的疗效受限于脑肿瘤的多层免疫逃逸机制：脑肿瘤会干扰
