角质素是一种丰富的结构性纤维状蛋白，也是一种极难降解的生物聚合物。β-角质素是羽毛的主要成分，由于家禽业规模庞大，已成为主要的废弃物。羽毛废弃物的生物技术升级回收因多种可降解角质素的细菌和真菌被分离而受到关注。这些微生物产生的被称为角质素酶（keratinase）的蛋白酶负责角质素的酶解水解。然而，赋予蛋白酶角质素分解活性的结构特性尚不清楚。本研究对来自嗜热菌Fervidobacterium pennivorans菌株T的类枯草杆菌S8内肽酶（FerB）的结构-功能关系进行了探究。FerB被结晶并以1.5 Å分辨率解析其结构，揭示了其处于自加工状态，其中前肽结构域非共价结合于催化结构域。切割肽键的羧基位于活性位点，并与催化三联体（catalytic triad）的丝氨酸残基处于氢键距离范围内。与fervidolysin不同，FerB不含β-三明治结构域，但在相应位置存在一个富含酪氨酸的β-发夹结构。删除该β-发夹会降低蛋白质的完整性和角质素酶活性。
《Enzyme and Microbial Technology》发表的该研究聚焦于嗜热菌Fervidobacterium pennivorans T株的角质素降解机制，针对当前角质素酶（keratinase）结构基础不足、难以指导羽毛废弃物高效生物升级的问题展开。家禽业每年产生大量羽毛废弃物，传统填埋、焚烧及化学水解处理存在环境污染或产物营养价值低等缺陷，微生物降解因其绿色可持续成为研究热点，但角质素酶特异性降解的结构机制尚不明确，限制了其工业应用。研究人员通过对该菌转录组与蛋白质组的分析，锁定显著上调表达的S8家族丝氨酸蛋白酶FerB，采用X射线晶体学解析其高分辨率三维结构，并结合定点突变、生化活性测定等方法，阐明了其独特结构特征与功能关联，为角质素酶的理性改造提供了结构依据。
研究中采用的主要关键技术方法包括：从Fervidobacterium pennivorans T株基因组中克隆FerB基因并进行密码子优化，构建原核表达载体；利用大肠杆菌异源表达并纯化重组蛋白；通过悬滴气相扩散法进行蛋白质结晶，收集X射线衍射数据并解析FerB的晶体结构；构建β-发夹缺失突变体，比较其与野生型的热稳定性及角质素降解活性；采用改良茚三酮法测定酶解产物中的游离氨基含量以量化酶活性。
3.1 表达与纯化
研究人员在37°C条件下成功实现FerB在大肠杆菌中的可溶性表达，但SDS-PAGE显示异常迁移现象，出现约40 kDa与70 kDa两条带，经LC-MS/MS测序证实均为全长FerB，提示其存在构象异构或异常凝胶相互作用。蛋白在低溫储存时会发生沉淀，但42°C孵育可完全复溶且不损失活性。
3.2 活性分析
FerB在未成熟状态下即可降解整根羽毛，反应液浊度显著增加。定量测定显示其在30–70°C范围内均具活性，最适pH为8.0，且在50–80°C热处理1小时后仍保留大部分活性，表明其为高度耐热蛋白酶。底物存在时可增强其热稳定性，且无需还原剂即可发挥角质素降解作用。
3.3 FerB整体结构
FerB晶体结构分辨率为1.5 Å，显示其由催化结构域（catalytic domain, CD）与前肽结构域（pro-peptide domain, PD）组成，后者在自加工后仍与催化结构域非共价结合。与fervidolysin相比，FerB缺少两个C端β-三明治结构域，取而代之的是位于相应位置的富含酪氨酸β-发夹（tyrosine-rich β-hairpin, TRBH）。
3.3.1 前肽结构域（PD）
PD折叠成四链反平行β-片层，其C末端延伸至活性位点，切割位点Leu97的羧基靠近催化三联体Ser357，可能参与调控自加工过程。
3.3.2 催化结构域（CD）
CD具有典型的SB折叠，包含保守催化三联体Asp134、His170和Ser357。结构中鉴定出两个钙离子结合位点Ca-1与Ca-2，其中Ca-2为FerB独有，由Asp327、Asp331、Asp335、Asn329侧链及Tyr333主链羰基配位。
3.3.3 富含酪氨酸β-发夹
TRBH由Tyr299至Tyr314构成，含七个酪氨酸残基及多个带电极性残基。删除TRBH后，突变体无法耐受热纯化，且在孵育过程中发生降解，羽毛降解活性显著降低，提示该结构对FerB的稳定性与功能完整性至关重要。
讨论部分指出，FerB代表了S8蛋白酶的一种新型结构亚型，其TRBH可能在底物识别或防止非特异性降解中发挥作用。与fervidolysin不同，FerB依赖TRBH而非大型β-三明治结构域来维持结构稳定与活性。研究结论表明，Fervidobacterium pennivorans T株通过表达FerB等多种蛋白酶协同完成羽毛的高效降解，FerB独特的TRBH结构为角质素酶的工程改造提供了新的靶点，有望推动羽毛废弃物的高值化生物转化。
