底物依赖性生长条件与水分动态驱动固态米曲霉（Aspergillus oryzae）发酵谷物及油籽加工副产物的香气形成

摘要 固态发酵（Solid-State Fermentation，SSF）利用丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）广泛应用于传统发酵工业，然而农业工业副产物中香气形成的调控机制尚不清楚。研究人员针对底物组成与动态水分条件如何影响SSF过程中的理化变化、代谢活性及挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs）形成展开研究。研究选取小麦麸皮、黑麦麸皮、菜籽饼粕及南瓜籽饼粕，在不同水分条件下接种米曲霉进行发酵，通过监测真菌生长量、pH值、水分活度、还原糖及伯胺水平追踪发酵进程，并对VOCs谱图进行时序分析，评估底物特异性和水分依赖性的香气演化轨迹。结果表明，不同底物与水分条件下的发酵行为差异显著：小麦与黑麦麸皮呈现相似的演化轨迹，表现为pH下降、适度失水及还原糖与伯胺含量上升；菜籽饼粕出现碱化现象并伴有大量胺类物质积累；南瓜籽饼粕pH变化有限，但水分活度显著下降且蛋白水解特征明显。VOCs分析显示，挥发性成分呈现从底物源性氧化产物向发酵源性代谢产物转变的趋势。与脂质氧化相关的直链醛类在谷物底物中迅速减少，而在油籽基质中持续存在更久。小麦与黑麦发酵中期醇类、酯类及酚类化合物短暂富集，香气复杂度提升，后期转向氨基酸源代谢产物；油籽底物则长时间保留支链及脂质源醛类，维持尖锐刺激性香气特征，菜籽发酵还因硫苷降解产生腈类与异硫氰酸酯。高水分条件促进乙酸及邻二酮类等氧化还原相关溢流代谢物的形成。研究证实，米曲霉SSF过程中的香气形成由底物与水分依赖的代谢连续体所决定，演化的水分活度与酶介导的底物转化动态调控代谢路径与挥发组构成，凸显了发酵阶段、底物化学性质及水分动态在调控多样化农业工业副产物制曲香气形成中的重要性。

研究背景与意义

全球食品系统贡献了约三分之一的温室气体排放，其中食品浪费占比达8%至10%，开发高效可持续的食品体系成为迫切需求。农业工业副产物富含营养与生物活性物质，通过固态发酵（SSF）技术可利用丝状真菌进行预处理以提升其经济价值，生产高附加值产品。制曲（Koji）发酵作为SSF的典型应用，主要依靠米曲霉（Aspergillus oryzae）产生的水解酶分解淀粉与蛋白质，同时生成大量挥发性有机化合物（VOCs）决定发酵食品的风味品质。然而，现有研究多集中于大米与大豆体系，对谷物与油籽加工副产物的发酵行为认识不足，且水分常被视为固定初始参数而非动态变量，底物性质、发酵条件与香气形成的关联尚未明确。为此，研究人员以小麦麸皮、黑麦麸皮、菜籽饼粕及南瓜籽饼粕为底物，探究米曲霉SSF过程中真菌生长、理化变化、代谢活性及香气形成的规律，旨在阐明SSF参数如何塑造代谢与感官结果，为食品加工副产物的定向风味设计提供理论依据。该研究成果发表于《Frontiers in Microbiology》。

主要技术方法

研究采用四类真实食品加工副产物作为样本队列：小麦麸皮与黑麦麸皮来自面粉生产，菜籽饼粕为商业热榨产物，南瓜籽饼粕由烤后南瓜籽经螺旋压榨制得。所有底物按批次设置单一变量进行重复发酵，谷物底物初始加水率为60%与70%（w/w），油籽底物为20%、30%与40%（w/w），发酵时长设为30、40与48小时。接种后于30°C、70%相对湿度静置培养，定期取样。表型评价采用半定量菌丝覆盖评分。理化与代谢分析涵盖水分含量、水分活度（Water Activity，a_w）、pH、还原糖（DNS比色法）及伯胺（邻苯二甲醛OPA法）。香气分析采用动态顶空-气相色谱-质谱联用技术（Dynamic Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，DH-GC-MS），结合PARADISe软件进行非靶向谱图解析与化合物鉴定，并使用R语言进行统计分析与可视化。

研究结果

3.1 菌丝生长受初始加水率影响

视觉评估显示，小麦与黑麦底物菌丝发育程度相近，南瓜在所有条件下均最低，菜籽饼粕在40%初始加水率下生长最强，表明初始水分显著影响不同基质的真菌定植。

3.2 底物依赖的理化与代谢谱变化

发酵引起所有底物pH、含水量、a_w、还原糖与伯胺的可测量变化，但方向与幅度各异。小麦与黑麦麸皮pH下降，含水量与a_w降低，还原糖与伯胺显著增加，反映协调的碳水化合物与蛋白质水解。菜籽饼粕pH升高，还原糖与伯胺大幅积累，含水量与a_w略降，提示强蛋白水解及氮代谢产氨。南瓜籽饼粕pH变化最小，a_w显著降低，伯胺上升明显而还原糖增幅有限，体现其独特的代谢模式。整体趋势表明，谷物底物糖与胺同步增加，油籽底物胺类增幅相对更高。

3.3 发酵条件对制曲香气谱的影响

3.3.1 重复样的主成分分析

主成分分析（PCA）显示前两个主成分共解释48.9%的方差，样品按底物类型沿PC1分离，谷物与油籽形成不同群组；PC2反映时间轨迹，谷物样品随发酵进程由早到晚分布。载荷图表明未发酵样品与油籽关联醛类，谷物发酵关联酮、酯与醇类，证实底物与发酵阶段共同塑造挥发组。

3.3.2 样品表型聚类

层次聚类热图将VOCs分为五大簇。谷物底物在30至40小时向发酵源性挥发物转变，油籽底物尤其在低水分下持续保留底物源性化合物。

3.3.3 簇1——直链醛与底物源性脂质氧化产物

包含丙醛、戊醛、己醛等线性醛类及2-戊基呋喃。此类化合物在未发酵底物中含量最高，发酵中谷物底物30小时后消失，油籽中持续存在但逐步下降，呈现底物依赖性衰退模式。

3.3.4 簇2——菜籽底物关联的氮硫化合物

包含乙酰胺、γ-丁内酯、丙酸及多种腈类与异硫氰酸酯，对应硫苷降解产物，构成菜籽特有的挥发性指纹，赋予苦辣、芥末样及硫磺气息。

3.3.5 簇3——发酵源性醇、酯与氨基酸降解产物

含高级醇、酯、酚类、支链醛与酸等。小麦与黑麦在30至40小时显著富集此类物质，48小时下降，反映中期发酵香气复杂度峰值；油籽底物无此协同增长，丰度较低且分散。

3.3.6 簇4——真菌脂质代谢与甲基酮

含2-庚酮、2-壬酮、2-十一烷酮、1-辛烯-3-醇等。未发酵底物中极低或无，发酵中随时间增加，48小时最高。小麦麸皮70%加水率下丰度最高，即便菌丝生长受限，表明挥发性形成可与生物量扩张解偶联。

3.3.7 簇5——高水分偏差簇

含乙酸、双乙酰、 acetoin乙酸酯、2-苯基-2-丙醇、4-乙基愈创木酚与1-丙醇。南瓜40%加水率与黑麦70%加水率样品聚集，暗示高水分下氧化还原失衡与部分发酵溢流代谢。

讨论与结论

研究首次通过GC-MS解析了米曲霉在谷物麸皮与油籽饼粕副产物上的挥发性形成规律，表明香气演化并非仅由初始水分决定，而是底物性质、酶促转化与动态水分演变共同塑造。所有底物水分活度均下降，油籽脱水更显著。谷物发酵伴随酸化与糖、胺同步积累，符合淀粉酶与蛋白酶协同作用；菜籽碱化则与氮代谢产氨相关。挥发组分为五个代谢区：簇1为底物脂质氧化产物，谷物中快速消退；簇2为菜籽硫苷源氮硫化合物；簇3为谷物中期特征性醇酯酚类；簇4为真菌脂质代谢甲基酮；簇5为高水分溢流代谢物。这些轨迹揭示了从生料氧化气味向发酵风味的转变，并指出了高水分下乙酸与双乙酰的过量风险及菜籽硫苷产物的感官限制。研究证实，底物化学与水分动态定义了不同的代谢香气机制，制曲发酵是食品副产物风味生成的有力工具。

结论部分翻译

本研究证明，米曲霉固态发酵过程中的香气形成由底物依赖的发酵轨迹所主导，并受到水分动态的调节，而非仅取决于初始加水量。谷物底物（小麦与黑麦麸皮）表现出协调的理化变化，包括酸化及还原糖与伯胺的同步增加，并伴有发酵源性醇类、酯类及酚类化合物的短暂富集。相比之下，油籽饼粕呈现底物特异性响应：菜籽饼粕的特征为碱化、胺类生成升高及硫苷源性腈类与异硫氰酸酯的积累；南瓜籽饼粕则表现出协调性较弱的代谢进程与更大的变异性。在所有条件下，挥发组聚类揭示了从底物源性脂质氧化产物向发酵源性化合物的转变，高水分条件下出现明显偏离，伴随乙酸、双乙酰及相关代谢物水平的升高。这些模式表明，水分通过改变基质结构与氧气可利用性影响代谢路径，从而塑造氧化途径与发酵途径之间的平衡。研究结果指出，发酵时间与适宜的底物依赖性水分水平对固态发酵香气谱的发育至关重要。