17β-雌二醇改变了轮虫Brachionus calyciflorus对聚苯乙烯纳米塑料的生殖效应（即剂量与反应之间的关系）

朱启斌|冯一凡|邢一夫|张宇|杨江华|韩崔|刘晓杰|杨家欣

南京师范大学海洋科学与工程学院，江苏省水生活饵料重点实验室，中国江苏省南京市210023

摘要

纳米塑料（NPs）能够吸附共存的污染物，但内分泌干扰化学物质如何影响纳米塑料的毒性仍不明确。我们使用淡水轮虫Brachionus calyciflorus，在300 μg L^–1的固定E2背景下，结合了70纳米聚苯乙烯NPs和17β-雌二醇（E2）的全因子设计以及聚焦的纳米塑料浓度梯度。双向方差分析（ANOVA）显示E2与NPs之间存在显著的交互作用，这影响了寿命、后代总数和最终种群密度，表明纳米塑料的效应依赖于背景浓度。在E2 = 300 μg L^–1时，低剂量NPs（1 μg mL^–1）使后代总数增加了18.29%，而5 μg mL^–1则减少了32.20%，形成了非单调的剂量-反应曲线。高斯拟合显示刺激峰值在1.11 μg mL^–1，大约的转变点在2.50 μg mL^–1。转移后0-4小时的校正相对内荧光在E300N5组中高于N5组。油红O染色和甘油三酯检测表明所有处理组中中性脂质均被消耗，qPCR显示tor基因在E300N5组中下调，同时rar/rxr基因以及与繁殖相关的vasa和nanos基因也受到抑制。总体而言，这些发现表明内分泌背景是一个能够重塑纳米塑料繁殖毒性的状态变量，对水生无脊椎动物的混合物风险评估具有重要意义。

引言

纳米塑料（NPs）通常被定义为小于1 μm的塑料颗粒，尽管一些研究采用更严格的上限100 nm，这与工程纳米材料一致（Rani-Borges和Ando，2024；Ali等人，2025）。与微塑料（MPs；1 μm–5 mm）相比，NPs具有更高的比表面积、更强的界面吸附能力，并表现出典型的胶体行为。这些特性增强了它们穿越生物屏障并通过多种细胞途径内化的潜力，从而复杂化了暴露动态和毒理学机制（Kögel等人，2020）。小于100 nm的NPs在斑马鱼幼体中比微米级的塑料颗粒更能引发中性粒细胞的募集和巨噬细胞的凋亡，这与更明显的肝脏炎症反应一致（Cheng等人，2022）。长期和全生命周期研究表明，NPs在数周到代际时间尺度上以及多个繁殖周期内，可以对生长、繁殖、代谢和微生物组产生多层面的亚致死效应（Liu Z.等人，2019；Liu等人，2020；Teng等人，2025；Rehman等人，2025）。暴露于微塑料和纳米塑料（MNPs）与水生生物的繁殖性能下降有关，这可能是通过氧化应激、内分泌干扰、能量失衡和发育紊乱引起的（Hasan等人，2025）。此外，几个终点的剂量-反应关系并不严格线性，可能表现出阈值或非单调模式（Agathokleous等人，2021），这对解释慢性生态影响具有重要意义。此外，由于NPs具有高表面反应性，它们可以吸附并浓缩共存的有机污染物、金属离子和内分泌干扰化学物质，形成复杂的污染物混合物，从而改变毒理学反应（Dong等人，2021；Kihara等人，2021；Trevisan等人，2022）。已有的研究表明，NPs（50–500 nm）能够以尺寸依赖的方式快速吸附17β-雌二醇（E2），并且NPs与合成雌激素己烯雌酚（DES）的共同暴露会加剧内分泌干扰并降低斑马鱼的繁殖能力（Lin等人，2023；Li等人，2025；Yang和Wang，2025）。因此，NPs可能通过改变激素的命运和生物利用度来改变激素暴露动态。由于MNPs既作为颗粒应力源又作为内分泌活性化学物质的载体，颗粒结合的内分泌干扰化学物质（EDC）的共同暴露可能会改变内部暴露和与内分泌相关的生物反应，而不仅仅是简单地将两个独立应力源相加（Bossio等人，2025）。

E2是一种强效的天然雌激素，主要通过人类排泄和集中动物饲养场的排放进入水生环境（Ying等人，2002；Meijide等人，2016）。虽然大多数地表水中的E2浓度通常在ng L^–1水平（Zhou等人，2012），但在接收未经处理的废水的水体中，其浓度可以显著增加，达到3310–15700 ng L^–1（Olatunji等人，2017）。在严重污染的局部热点地区，甚至报告了更高的浓度（Afifi等人，2016）。这些数值表明E2暴露在空间上是异质的，在受废水影响或局部污染的情况下可能会显著升高，其中塑料颗粒和类固醇雌激素经常共存。在这种栖息地中，水生生物通常面临的是污染物混合物，而不仅仅是单一的应力源。由于NPs可以与类固醇雌激素相互作用，并且内分泌活性化学物质可能会改变生理状态、能量分配和繁殖敏感性，因此确定雌激素背景是否可以改变纳米塑料剂量-反应关系的方向和形状仍然很重要。作为代表性的内分泌干扰化学物质，E2可以模拟或干扰内源性激素信号传导，导致性别比例失衡、卵黄蛋白（VTG）表达异常以及水生生物的繁殖力下降（Kidd等人，2007）。最近的一项研究进一步表明，MPs和E2的共同暴露在Eriocheir sinensis的肌肉和卵巢组织中引起了交互毒性（Fu等人，2024），这表明仅监测溶解的E2可能会误判暴露潜力和生物效应，特别是在存在塑料颗粒的情况下。在这种情况下，吸附-解吸过程可以改变E2的传输和生物利用度，从而改变水生生物接收的有效内部剂量和由此产生的内分泌反应。

浮游动物在食物网中起着关键作用，最近对轮虫的研究表明，复杂的污染物混合物可以在不同代际之间引起多层面的毒性和持久效应，突显了它们的广泛生态重要性（Feng等人，2024；Feng等人，2026）。鉴于淡水系统可以接收E2输入，并且NPs可以与类固醇雌激素相互作用（Waniek等人，2025；Liu X.等人，2019；Hu等人，2020），浮游动物可能在不同的雌激素背景下暴露于纳米塑料。然而，关于雌激素背景是否可以改变纳米塑料剂量-反应关系，以及这种调节是否伴随着内部荧光负担、脂质储备和候选分子反应的变化，证据仍然有限。特别是，将生活史和种群终点与基于荧光的吸收-清除观察和分子反应相结合的综合研究很少。在这项工作中，我们使用了淡水轮虫Brachionus calyciflorus，这是一种关键的浮游生物物种，也是经过充分验证的生态毒理学模型（Snell和Moffat，1992；Janssen等人，1994；Mills等人，2017）。轮虫已被广泛用于EDC筛选和繁殖毒性评估，因为它们的繁殖终点对内分泌活性化合物敏感（Preston等人，2000；Radix等人，2002；Yang和Snell，2010；Liang等人，2026）。聚苯乙烯NPs的暴露也被证明会影响轮虫的繁殖终点，进一步支持了该模型用于颗粒毒性评估的适用性（Kumar等人，2025）。我们整合了个体生活史特征、种群表现、基于荧光的吸收-清除动态、脂质终点和目标基因表达谱，以研究E2背景如何改变不同生物层面的纳米塑料反应。所选的基因组涵盖了内分泌/视黄醇信号传导、能量感知、脂质代谢、氧化应激和与繁殖相关的标记物。

章节片段

化学物质和纳米塑料

17β-雌二醇（E2；纯度≥98%）从Sigma-Aldrich购买。在二甲基亚砜（DMSO）中制备了1000 mg L^–1的储备溶液，并用EPA中等硬度的水（1 ×；每升去离子水含96 mg NaHCO₃、123 mg MgSO₄·7H₂O、60 mg CaSO₄·2H₂O和4 mg KCl）稀释至使用浓度。所有暴露介质中的最终DMSO浓度≤0.01%（v/v）。荧光（绿色）和非荧光聚苯乙烯NPs（标称直径70 nm）

PS-NPs的物理化学特性和分散行为

扫描电子显微镜（SEM）观察显示PS-NPs呈球形，表面相对光滑，初级颗粒大小分布均匀（图1A）。从SEM图像中量化的平均初级颗粒直径为69.89 ± 3.23 nm（图1B）。傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）分析进一步基于聚苯乙烯的特征吸收带确认了PS-NPs的化学身份（图1C）。在0小时时，PS-NPs的流体动力学直径（PDI）和ζ电位在EPA培养基和含E2的EPA培养基之间相当

讨论

寿命、繁殖力和种群增长率是反映轮虫适应性和对污染物敏感性的关键生活史特征（Jeong等人，2021）。在本研究中，暴露于5 μg mL^–1的70 nm NPs会缩短B. calyciflorus的寿命和繁殖能力。轮虫中的纳米塑料毒性与其颗粒大小密切相关（Jeong等人，2016）。例如，70 nm NPs在≥5 μg mL^–1时损害了Brachionus plicatilis的生存和繁殖（Sun等人，2019），而50 nm NPs在≥10 μg

结论

在测试的效果窗口条件下，雌激素背景改变了B. calyciflorus对聚苯乙烯NPs的繁殖反应，在繁殖和种群终点上产生了方向不同的效应。在E300条件下，NPs产生了双相剂量-反应曲线，低剂量时具有刺激作用，高剂量时抑制作用更强。吸收-清除观察表明，在清除阶段校正后的相对内荧光更高，并且信号保留更持久

数据可用性

数据将应要求提供。

CRediT作者声明

朱启斌：研究、正式分析、初稿撰写。冯一凡：软件、验证、审稿与编辑。邢一夫：软件、验证。张宇：软件、验证。杨江华：数据管理。韩崔：数据管理。刘晓杰：数据管理。杨家欣：概念化、方法论、审稿与编辑。所有作者都审阅了最终稿件。

CRediT作者贡献声明

朱启斌：初稿撰写、研究、正式分析。冯一凡：验证、软件。邢一夫：验证、软件。张宇：验证、软件。杨江华：数据管理。韩崔：数据管理。刘晓杰：数据管理。杨家欣：审稿与编辑、方法论、概念化。