一种耐氧古菌脱水酶实现了在贪铜菌 Cupriavidus necator 中由葡萄糖和 CO2合成含4-羟基丁酸聚酯的人工途径

4-羟基丁酸（4HB）及其相关化合物是化学工业中的重要物质，而通过采用梭菌酶的三羧酸循环（TCA cycle）路线进行4HB生产的微生物代谢工程研究已率先展开。本研究聚焦于一条用于4HB-CoA生成的替代性高能效途径，该途径利用了来源于另一生命域的一种独特酶。含有[4Fe-4S]簇的4HB-CoA脱水酶（4HcD）可催化基于自由基（radical）的非典型脱水/水合反应，但由于其对活性氧（reactive oxygen species）高度敏感，因此属于难以应用于生物技术体系的一类酶。当前结果表明，来源于好氧古菌的耐氧4HcD使得聚羟基脂肪酸酯（PHA）生产菌 Cupriavidus necator 中由巴豆酰-CoA向4HB-CoA的转化成为可能。该古菌酶有助于建立一种在低通气条件下具有能量优势并可生成ATP的聚（3-羟基丁酸-共-4-羟基丁酸）生物合成途径。通过重构宿主中的C4-酰基-CoA代谢，并修饰4HcD的N端以潜在提高其翻译效率，研究人员获得了最高达12.6 mol %的4HB摩尔分数，同时抑制了宿主固有的3-羟基己酸掺入。该途径进一步扩展至气体发酵条件下的化能自养代谢（chemolithoautotrophic metabolism），实现了由CO₂和H₂直接生产该共聚酯。综上，这些发现凸显了将古菌催化功能整合进氧化氢细菌中的潜力，这为推进碳捕获以及功能性生物聚合物的可持续生物合成提供了一种有前景的策略。

该论文发表于《ACS Synthetic Biology》，围绕一种此前难以在需氧生物制造体系中应用的自由基酶——4-羟基丁酰辅酶A脱水酶（4HcD，催化4HB-CoA与巴豆酰-CoA之间转化的金属黄素酶）展开，构建了Cupriavidus necator中一条新的含4-羟基丁酸（4HB）聚酯生物合成路线。研究背景在于，4HB及其衍生物如γ-丁内酯、1,4-丁二醇以及含4HB的聚羟基脂肪酸酯（PHA）具有重要工业与医用价值，尤其是聚（3-羟基丁酸-共-4-羟基丁酸）[P(3HB-co-4HB)]和聚（4-羟基丁酸）[P(4HB)]兼具生物可降解性与优良材料性能。然而，过去30年中主流4HB生物制造策略几乎都依赖于以琥珀酰-CoA为中间体的三羧酸循环（TCA cycle）相关路线，需要异源表达SucD、4HbD和OrfZ/Cat2等多步酶促模块，不仅路径较长，而且涉及还原力平衡、琥珀酸半醛毒性及宿主竞争代谢等问题。相比之下，若能直接利用巴豆酰-CoA经4HcD生成4HB-CoA，则有望建立一条更短、更节能且不依赖TCA循环的人工途径。但常规细菌来源4HcD通常含有对氧敏感的[4Fe-4S]簇，难以在好氧或兼性自养底盘中发挥功能，因此开发耐氧4HcD并验证其在生物制造中的可行性具有重要意义。

研究人员选择来源于好氧氨氧化古菌 Nitrosopumilus maritimus 的耐氧型4HcD，在PHA生产底盘 C. necator 中进行异源表达，以检验其是否能够在需氧条件下打通由巴豆酰-CoA到4HB-CoA的转换，并进一步支持P(3HB-co-4HB)的从头合成。研究结果表明，该古菌酶在低供氧条件下具备功能活性，可使工程菌直接以葡萄糖为碳源合成含4HB单元的共聚酯。进一步通过系统重构宿主C4-酰基-CoA代谢网络，削弱竞争通路并增强对巴豆酰-CoA的利用后，4HB单体摩尔分数提高至10.5 mol %；在此基础上，通过对4HcD N端进行插入修饰，进一步将4HB比例提高至12.6 mol %，同时消除了宿主内源3-羟基己酸（3HHx）单体的并入。更重要的是，研究人员将该人工途径延伸至化能自养气体发酵模式，利用CO₂和H₂直接合成P(3HB-co-4HB)，证明该路径不仅适用于异养体系，也适用于碳固定驱动的可持续生物制造。论文的核心结论在于：耐氧古菌4HcD能够在C. necator中建立一条TCA循环非依赖、能量学更有利的4HB-CoA供应通路，为由葡萄糖乃至CO₂生产高附加值4HB聚酯提供了新方案。

研究人员采用的关键技术方法主要包括以下几个方面。首先，构建了密码子优化的古菌4hcD表达系统，并在可利用葡萄糖、携带工程化PHA合酶 phaC_NSDG的C. necator中进行异源表达。其次，采用同源重组介导的多基因缺失，对phaB1、phaB2、phaB3、bktB、phaJ4a、fadB′和fadB1等与C4-酰基-CoA代谢及逆向β-氧化相关的基因进行代谢重构。再次，在异养条件下通过限制氮源培养和低通气摇瓶发酵评估P(3HB-co-4HB)合成表现，并通过补加不同短中链酸分析代谢前体贡献。随后，利用¹H NMR、气相色谱（GC）和凝胶渗透色谱（GPC）测定聚酯组成与分子量。最后，借助集成水电解的循环气体闭路系统（RGCC）开展以CO₂/H₂为底物的自养气体发酵，监测气体组成、溶氧、pH及产物积累，从而验证该途径在自养模式中的可行性。

Establishment of the P(3HB-co-4HB) Biosynthesis Pathway from Glucose in C. necator using 4HB-CoA Dehydratase from Aerobic Archaeon
该部分首先验证了耐氧古菌4HcD在C. necator中的功能可行性。研究人员将来自 N. maritimus 的4HcD表达于缺失phaB1的工程株中，理论上该酶可将由乙酰-CoA衍生的巴豆酰-CoA直接转化为4HB-CoA，从而建立一条新型聚酯合成路线。结果显示，在常规高通气条件下，所得PHA中4HB掺入仅为痕量；而在低通气微需氧条件下，4HB比例提高至3.8 mol %，表明该酶虽具耐氧性，但其功能仍明显受氧水平影响。研究还发现，不同启动子驱动方式并未进一步提升4HB掺入。通过补加巴豆酸及不同链长脂肪酸分析，研究人员推断葡萄糖条件下细胞内巴豆酰-CoA供应已接近充足，限制因素更可能来自酶活性稳定性或竞争代谢，而非单纯底物不足。

Metabolic Rewiring of C. necator for P(3HB-co-4HB) Biosynthesis
该部分通过宿主代谢重构提高4HB单体比例并减少副单体形成。研究人员首先排除了4HB降解通路对产物形成的显著影响，因为删除内源4HB脱氢酶编码基因后PHA组成变化不大。随后，重点改造与巴豆酰-CoA生成和消耗相关的C4-酰基-CoA代谢网络。结果表明，phaB1缺失是实现4HB掺入的关键，提示巴豆酰-CoA主要来自(S)-3HB-CoA脱水而非(R)-3HB-CoA。进一步删除次要还原酶基因phaB3和phaB2后，4HB比例继续增加。另一方面，删除bktB或phaJ4a可阻断原有逆向β-氧化形成3HHx的支路，尤其phaJ4a缺失后，共聚酯中不再检测到3HHx单体。删除fadB′或fadB1则分别将4HB比例由3.8 mol %提高至5.3 mol %和6.2 mol %，说明这两种双功能β-氧化酶主要参与将巴豆酰-CoA重新导回乙酰乙酰-CoA方向，从而与4HcD竞争底物。整合多重缺失后，八基因缺失菌株Δ3BΔ4在表达4HcD时可由葡萄糖生产含10.5 mol % 4HB、细胞内聚酯含量达54.7 wt %的P(3HB-co-4HB)，证明系统性代谢改造对新通路效率提升具有决定性作用。

N-terminal Modification of the Archaeal 4HcDNm in C. necator
该部分针对4HcD表达效率进行分子层面的优化。研究人员依据已有关于翻译起始后早期延伸效率的报道，在4HcD N端引入编码Lys-Tyr或Lys-Ile的6 bp插入。结果显示，nKY变体在基础工程株中可将4HB掺入提高至约5.5 mol %，优于野生型酶的3.8 mol %；在深度代谢重构株Δ3BΔ4中，该变体进一步将4HB比例从10.5 mol %提高至12.6 mol %，且PHA总含量保持相近。这提示N端AU富集相关设计可能通过提高翻译效率，间接缓解耐氧酶表达量不足带来的限制。相较之下，C端添加Lys或Lys-Lys并未改善聚酯合成，说明此类稳定性优化策略在本体系中作用有限。

NMR Analysis and Molecular Weights of P(3HB-co-4HB)
该部分完成了产物结构与聚合物性质验证。¹H NMR分析证实，优化菌株Δ3BΔ4/pBPP-4HcD-nKY产生的聚合物确为由(R)-3HB和4HB组成的共聚酯。分子量分析显示，这些共聚物的重均分子量（M_w）约为7.2–7.5 × 10⁵，数均分子量（M_n）约为1.9–2.3 × 10⁵，分子量水平高于既往通过前体补料获得相似4HB比例的材料。研究据此认为，约10–12 mol %的4HB组成结合10⁵量级高分子量，使所得聚酯更具实际应用潜力。

Autotrophic Production of P(3HB-co-4HB)
该部分将4HcD介导的新路线拓展至CO₂直接转化场景。研究人员利用集成质子交换膜（PEM）电解器的RGCC闭路循环气体发酵系统，在低H₂浓度、非可燃气氛中培养Δ3BΔ4/pBPP-nKY-4HcD。为兼顾生长与4HcD活性，前48 h采用7.0 vol % O₂促进细胞增长，随后在PHA积累期将O₂浓度降至3.5 vol %以营造更有利于该酶发挥作用的微需氧环境。结果显示，细胞在前期主要增长，72 h后在氮磷双限制下开始明显积累PHA。最终由CO₂和H₂直接合成的P(3HB-co-4HB)中，4HB比例达到9.8 mol %，细胞聚酯含量为38.2 wt %；在48–96 h的PHA积累阶段，PHA含量达到49.9 wt %。培养液中短暂积累乙酸和3HB，且后期又被再利用，提示在低氧自养合成条件下，重构代谢网络与整体代谢状态之间仍存在一定不协调，但并未影响该路线从CO₂直产4HB共聚酯的概念验证。

Discussion
讨论部分强调，本研究的创新性在于将一种具有非典型自由基催化机制、通常难用于生物技术的4HcD成功转化为实际生物制造工具。与传统依赖琥珀酰-CoA的4HB合成路线不同，本研究建立的路线绕过TCA循环，仅需一个异源酶即可将C. necator内源代谢生成的巴豆酰-CoA接入4HB-CoA合成，从而显著简化了路径结构。研究还通过分析多基因缺失导致的聚酯组成变化，界定了宿主中与底物流向竞争有关的关键节点，尤其明确了FadB′和FadB1对巴豆酰-CoA可利用性的负面影响，以及bktB、phaJ4a对3HHx支路形成的贡献。能量学比较进一步显示，4HcD介导路线在葡萄糖异养条件下可净生成1分子ATP，而传统SucD-4HbD-OrfZ/Cat2路线则需额外消耗ATP；在自养条件下，新路线合成1分子4HB-CoA理论上需要14个ATP，也低于传统路线的16个ATP。因此，这一路径在理论上更具能量优势。研究人员同时指出，自养培养中乙酸与3HB的瞬时分泌现象说明当前重构菌株仍有进一步优化空间，但整体结果已充分表明，将古菌催化功能引入氧化氢细菌，是连接碳捕获与高值生物材料合成的可行策略。

研究结论部分可译为：
本研究表明，来源于好氧古菌的耐氧4HB-CoA脱水酶能够在Cupriavidus necator中建立一条此前无法实现的、独立于TCA循环的4HB-CoA生物合成途径。通过对宿主C4-酰基-CoA代谢的重构以及对4HcD N端的优化修饰，研究人员实现了由葡萄糖合成4HB摩尔分数最高达12.6 mol %的P(3HB-co-4HB)，同时抑制了3HHx单体的掺入。该途径还可进一步耦联化能自养气体发酵，实现由CO₂和H₂直接生产该共聚酯。总体而言，研究结果证明了将古菌酶学功能整合进氧化氢细菌中，可作为推动碳捕获与功能性生物聚合物可持续合成的一种有前景策略。