近端小管体外系统是临床前药物开发中的重要工具，可为药物处置和安全性研究提供见解。细胞通常在含有胎牛血清（FCS）的培养基中培养；然而，对于人源细胞而言，添加FCS在生理学上并不具备相关性。本研究将人肾脏近端小管细胞的体外培养转化为无FCS培养基。研究人员评估了无FCS培养基对常用的、过表达药理学相关有机阴离子转运蛋白1（ciPTEC-OAT1）的条件性永生化近端小管上皮细胞在多次传代过程中的成熟和维护的影响。该转运蛋白在肾小管细胞分离和体外培养后会丢失，由于其临床相关性，研究人员选择了表达OAT1的细胞系。使用人血小板裂解物（hPL）补充无FCS培养基支持了长期的细胞生长。在这两种条件下，OAT1介导的荧光素转运均对丙磺舒（probenecid）抑制敏感，尽管无FCS培养物中的细胞内荧光素积累减少了。差异表达基因的KEGG和GO富集分析显示，在无FCS培养物中，炎症反应和HIF-1信号通路下调，而细胞黏附和ATP结合盒（ABC）转运蛋白基因上调。有趣的是，在优化的无FCS培养基中培养的ciPTEC-OAT1的生物能量学特征有所增加。此外，在3D生物工程肾小管培养中，补充增加浓度的人血小板裂解物改善了细胞活力和纤维覆盖度。总之，研究人员强调了将ciPTEC-OAT1培养从含FCS培养基转向无FCS培养基的重要努力和策略。
论文解读：向无胎牛血清（FCS）培养体系的转化增强肾脏近端小管细胞生物能量学及药理学应用
研究背景与意义
在临床前药物开发过程中，肾脏近端小管体外培养系统是研究药物 disposition与安全性评价的重要工具。目前，这类细胞模型通常在含有胎牛血清（Fetal Calf Serum, FCS）的培养基中进行培养。然而，FCS的成分未定义、批次间差异大，且对于人源细胞而言缺乏生理相关性，同时存在伦理争议。因此，开发成分明确、更具人源生理相关性的无FCS培养基，对于提升体外模型的预测价值（如应用于多器官芯片系统）具有重要意义。本研究针对条件性永生化人肾脏近端小管上皮细胞（ciPTEC-OAT1，过表达有机阴离子转运蛋白1 Organic Anion Transporter 1, OAT1），系统地探索了从含FCS培养基向无FCS培养基过渡的策略，评估了其对细胞功能、基因表达、生物能量学及3D培养的影响，论文发表于《Cell and Tissue Research》。
主要关键技术方法
研究人员主要采用人ciPTEC-OAT1细胞系（源自健康人尿液样本，由Cell4Pharma提供）。关键实验方法包括：在2D平面及3D中空纤维膜（Hollow Fiber Membranes, HFM）上进行的细胞培养；通过添加不同补充剂（如人血小板裂解物 human Platelet Lysate, hPL）优化无FCS培养基（基于Advanced DMEM-F12）；利用PrestoBlue assay评估细胞活力；通过荧光素摄取实验及丙磺舒（probenecid）抑制试验评估OAT1功能；进行RNA测序（RNA-seq）及KEGG/GO富集分析以解析转录组变化；利用靶向蛋白质组学（质谱）检测药物转运蛋白的蛋白丰度；使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试（Mito Stress Test）分析细胞生物能量学（氧消耗速率 OCR 和胞外酸化速率 ECAR）；并在3D生物工程肾小管模型中评估不同hPL浓度及动态培养条件的影响。
研究结果
Culturing ciPTEC-OAT1 in FCS-free medium resulted in reduced cell density and OAT1 functionality, without compromising cell viability（在无FCS培养基中培养ciPTEC-OAT1导致细胞密度和OAT1功能降低，但不影响细胞活力）
研究人员发现，在成熟阶段将ciPTEC-OAT1转换为无FCS培养基后，基于蛋白含量测定的细胞密度显著降低，显微镜观察也证实了这一点。当数据根据蛋白含量归一化后，无FCS与含FCS培养物的细胞活力具有可比性（除添加B27的无FCS组活力降低外）。两种培养条件下的细胞均显示出功能性的OAT1介导的荧光素摄取，且该摄取可被丙磺舒抑制，但无FCS培养物中的细胞内荧光素积累显著减少。不同的细胞外基质包被条件不影响这一总体趋势。
Addition of human platelet lysates to FCS-free medium supports longer-term expansion and passaging of ciPTEC-OAT1 cultures（向无FCS培养基中添加人血小板裂解物支持ciPTEC-OAT1培养物的长期扩增和传代）
研究人员发现，仅使用无FCS培养基（不补充hPL）时，细胞在传代一次后停止扩增；而补充1% ELAREM Perform™（hPL）的优化无FCS培养基可支持细胞稳定培养至少5代。虽然无FCS条件下的细胞计数在培养第10天低于含FCS条件，但细胞形态和汇合度尚可。
ciPTEC-OAT1 transcriptomics analysis reveals substantial gene expression changes after culture in optimized FCS-free medium（ciPTEC-OAT1转录组分析揭示优化无FCS培养基培养后基因表达的显著变化）
转录组分析显示，含FCS与无FCS培养的ciPTEC-OAT1在PCA图中沿PC1明显聚类。无FCS培养中有1183个基因上调、1071个基因下调。KEGG和GO分析表明，无FCS组中炎症反应、对外部刺激的反应以及HIF-1信号通路下调；而细胞黏附相关通路、细胞黏附分子（Cell Adhesion Molecules）及ATP结合盒（ABC）转运蛋白基因上调。
Decreased OAT1 expression and function with increased expression of efflux drug transporters in cells cultured in optimized FCS-free medium（在优化无FCS培养基中培养的细胞OAT1表达和功能降低，而外排药物转运蛋白表达增加）
研究人员评估了临床相关肾小管药物转运蛋白的表达。无FCS培养细胞中OAT1的mRNA表达（相对GAPDH）和蛋白丰度分别降低了2.5倍和2.7倍，OAT1功能（荧光素摄取）降低了约8.2倍。相反，某些外排转运蛋白如MRP4（mRNA 2.8倍，蛋白1.5倍）和P-gp（mRNA 4.1倍，蛋白3.1倍）在无FCS培养中上调。OAT1的排名从含FCS时的第一位降至无FCS时的第三位（次于P-gp和MRP4）。
Optimized FCS-free ciPTEC-OAT1 cultures show improved bioenergetic phenotype and comparable cell viability（优化的无FCS ciPTEC-OAT1培养显示改善的生物能量学表型且细胞活力相当）
Seahorse线粒体压力测试显示，在优化无FCS培养基中培养的ciPTEC-OAT1，其最大呼吸（maximal respiration）和备用呼吸能力（spare respiratory capacity）分别是含FCS培养的5倍和13.5倍（接种12,000细胞/孔时）。基础呼吸、ATP产生偶联呼吸和非线粒体耗氧也显著增加，表明更偏向氧化表型。细胞活力（归一化后）略有下降。
Higher percentage of human platelet lysates improves cell viability and coverage of bioengineered kidney tubules in FCS-free cultures（更高比例的人血小板裂解物改善无FCS培养中生物工程肾小管的细胞活力和覆盖度）
在3D HFM培养中，增加细胞接种密度或增殖时间对代谢活性和覆盖度的改善有限。而提高无FCS培养基中的hPL浓度（1%至10%）则呈现出代谢活性和细胞覆盖度的剂量依赖性增加。10% hPL组代谢活性是1% hPL组的2.1倍，免疫染色显示细胞层连续，类似于含FCS条件。因此选用10% hPL进行后续HFM实验。
Dynamic culture conditions slightly improve bioengineered kidney tubules in FCS-free cultures（动态培养条件轻微改善无FCS培养中的生物工程肾小管）
研究人员评估了不同细胞外基质包被（胶原IV单独或与层粘连蛋白-332组合），未发现对代谢活性有持续影响。在静态培养1天后，于6天成熟期内采用3D摇床动态培养，可使代谢活性提高19%，达到含FCS培养物的85%。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究逐步建立了ciPTEC-OAT1向无FCS培养基的过渡方案，虽细胞密度和OAT1功能降低，但hPL补充支持了长期传代。转录组变化显示HIF-1信号和炎症反应下调，ABC转运蛋白上调，与更氧化、更成熟的表型一致。生物能量学分析是核心发现，无FCS培养显著增强了线粒体呼吸能力。在3D模型中，hPL浓度需优化（10%较优），动态培养有益。但OAT1功能下降需在未来研究中解决（如恢复其功能），以拓展其在依赖OAT1摄药和肾毒性评估中的应用。结论强调，该研究展示了将ciPTEC-OAT1培养（2D和3D HFM）从含FCS转向无FCS体系的重要策略和成果，添加hPL是长期扩增所必需的，优化无FCS培养有助于研究线粒体呼吸，且培养基配方显著影响近端小管体外系统的关键终点，但仍需更多表征研究。
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