摘要：局部晚期直肠癌的标准治疗包括新辅助放化疗（nCRT）序贯全直肠系膜切除术，但该方案伴随显著的发病率，且常因术中肿瘤可视化不佳导致切除不完整。对于达到nCRT完全缓解的患者，观察等待（W&W）策略可免于手术，但目前的影像学技术难以充分识别完全缓解者，导致约30%的病例出现再生。为改进nCRT疗效评估并引导切除，研究人员开发了PH10，一种局部应用的pH可激活近红外（NIR）荧光探针，用于快速、肿瘤特异性成像。PH10是一种小分子花青类似物，在小鼠模型和人类肿瘤标本（n = 11）中进行了测试。在相关临床时间窗内，评估了体内的体内及离体荧光激活、肿瘤特异性和肿瘤背景比（TBR）。PH10实现了快速且特异的肿瘤可视化，在小鼠模型体内1分钟内达到中位TBR为3.2，在人类样本离体10分钟内达到2.2。该探针在酸性肿瘤微环境（TME）内对肿瘤组织表现出高特异性，且无需全身给药或长时间孵育。PH10是一种有前景、起效快的局部NIR制剂，用于结直肠癌内镜和手术期间实时肿瘤检测。其简易性和快速动力学支持潜在的临床转化。此外，其pH可激活机制可将其效用扩展至具有酸性微环境的其他实体癌。
论文解读：利用局部应用pH可激活荧光团实时检测结直肠癌
研究背景与意义：
局部晚期直肠癌的标准治疗模式为新辅助放化疗（nCRT）后行全直肠系膜切除术，该手术伴随显著术后并发症与发病率，且远端直肠复杂解剖结构及nCRT诱导的纤维化使术中准确识别肿瘤边界变得困难，导致高达20%的病例出现肿瘤阳性手术切缘（R1切除），进而增加局部复发风险、影响总生存并提升医疗成本。此外，约15%–20%接受nCRT的直肠癌患者可达病理完全缓解（pCR），此类患者可采用器官保留的观察等待（W&W）策略以维持生活质量；然而，常规影像学（如MRI、内镜）在术前准确识别pCR存在局限，W&W管理患者中临床完全缓解与病理完全缓解的不匹配可致高达38%的局部再生率。因此，在临床直肠癌管理中，亟需先进成像技术以解决两个关键环节：其一为nCRT后治疗反应的內镜评估，以筛选适合W&W的候选人；其二为手术期间残留肿瘤的术中检测，以防止不完全切除。近红外（NIR）荧光成像（FI）结合肿瘤特异性荧光剂与NIR光（700–900 nm），可在荧光分子内镜（FME）与荧光引导手术（FGS）中实现实时光学成像，有望提升肿瘤可视化水平；但现有用于结直肠癌成像的NIR制剂常受限于特异性差、脱靶荧光、需静脉给药或局部应用后长时间孵育，阻碍临床采用。酸性肿瘤微环境（TME）因癌细胞代谢改变（Warburg效应）呈弱酸性（pH 6.4–7.1），是通用且可及的激活成像靶点；多数现有pH敏感探针仅在相对低pH（<5.0）激活，不适用于检测弱酸性TME，可能导致假阴性与残留肿瘤漏检。基于此，研究人员开发了PH10，一种pH可激活、荧光猝灭的成像制剂，经优化用于局部应用，具备最小非特异性背景信号、降低全身副作用风险及易整合入手术与内镜流程等优势，论文发表于《Molecular Diagnosis》。
主要关键技术方法：
研究人员通过化学合成获得pH可激活NIR探针PH10（及对照PH09），并利用光谱法测定光物理与光化学性质；通过细胞实验（结直肠癌MC38细胞、成纤维NIH3T3细胞、卵巢癌ID8细胞）评估细胞摄取机制（采用有机阴离子转运肽OATP抑制剂BSP与低温条件）、亚细胞定位（线粒体与溶酶体追踪）、pH依赖性成像及细胞毒性（IC50 ）；建立小鼠皮下结直肠癌异种移植模型与腹腔播散卵巢癌模型，采用自定义FLARE NIR成像系统进行体内与离体 topical喷洒成像，计算肿瘤背景比（TBR）；开展离体人标本验证，纳入荷兰海格兰登医疗中心行结肠癌手术的患者（n=10，含11个组织学确认结肠癌），标本离体后纵向切开并局部应用PH10（50 µM或500 µM），于规定时间点获取可见光与NIR荧光图像（Pearl Trilogy成像系统），并进行组织切片、H&E与Ki-67免疫组化染色、显微NIR荧光扫描，采用QuPath与MeVisLab软件定量平均荧光强度（MFI）与TBR，统计方法包括Wilcoxon符号秩检验、Mann–Whitney U检验与Pearson相关分析。
研究结果：
3.1 pH可激活NIR探针的合成与光物理化学性质：研究人员合成含环己硫酮环的花青类似物PH09（无pH激活官能团对照）与PH10（经SNR 1反应引入二级胺作为pH敏感基团）。PH10在pH 7.4时logD为1.92，pH 5.0时降至0.44；pH 5.0下吸收红移且荧光强度较pH 7.4提升近2倍，而PH09无显著pH依赖荧光变化。光稳定性测试显示，pH 5.0下照射3小时后PH10保留35%荧光强度（PH09为27%），pH 7.4下两者均保留27%。密度泛函理论（DFT）计算表明，低pH下PH10质子化使前线分子轨道能隙减小，解释吸收波长变化与荧光增强。
3.2 pH可激活NIR探针的癌细胞靶向性：MC38细胞摄取实验显示，OATP抑制剂BSP与4°C冷条件均显著降低PH09与PH10荧光信号，表明摄取经由OATP介导。
3.3 癌细胞内的滞留机制：PH09在 normal fibroblast NIH3T3细胞中蓄积显著多于MC38细胞，而PH10在MC38细胞中摄取显著更高；共定位分析显示PH10主要蓄积于线粒体（67%）与溶酶体（32%），PH09主要在线粒体（62%）与溶酶体（24%），PH10在两类细胞器内蓄积均高于PH09。
3.4 pH可激活NIR探针的细胞毒性：MC38细胞IC50 为PH09 8.0 µM、PH10 2.4 µM；normal NIH3T3细胞IC50 为PH09 6.7 µM、PH10 5.5 µM；ID8细胞IC50 为PH09 6.7 µM、PH10 4.7 µM。
3.5 局部应用pH可激活探针的体内效力：小鼠皮下MC38肿瘤模型皮肤去除后喷洒探针，500 µM PH10局部应用1分钟并清洗三次后，肿瘤相对周围正常组织TBR约3.2，PH09 TBR约0.9；剂量探索显示500 µM TBR最高（3.2），250 µM次之且与500 µM无显著差异；离体分析确认500 µM组信号显著高于50 µM组；组织学显示PH10荧光位于肿瘤结节表层数层、肿瘤间质与瘤周包膜。
3.6 离体验证研究中的患者与肿瘤特征：共纳入10例患者（11个结肠癌），中位年龄67岁，多数腺癌（91%），大部分中低级别（82%），pT分期自pT1至pT4a，中位最大径40 mm。
3.7 局部应用PH10在离体可检测结肠癌并与健康组织具足够对比度：局部应用PH10（50–500 µM）后，肿瘤区域出现清晰界定荧光信号；最终清洗后肿瘤组织平均荧光强度（MFI）显著高于邻接健康组织（P<0.001）；11个肿瘤中位TBR为2.2（IQR 1.8–2.9）；500 µM组中位TBR 2.5显著高于50 µM组1.4（P=0.012）；50 µM组3个肿瘤中2个TBR<1.5，500 µM组8个肿瘤TBR均≥2.0；显微荧光与H&E、Ki-67染色吻合。
3.8 连续清洗步骤提升TBR：每轮盐水清洗后肿瘤与背景MFI均下降，但因背景下降更显著，中位TBR自孵育10分钟未清洗时1.4升至三次清洗后2.2。
3.9 PH10荧光强度与Ki-67表达水平相关：组织切片上肿瘤Ki-67平均染色强度（MSI）显著高于邻接健康黏膜（P=0.01），肿瘤Ki-67 MSI与同区域荧光信号强度（MFI）呈正相关（r=0.65，P=0.031），即增殖更高肿瘤荧光更强。
3.10 显微荧光成像显示PH10在人体内组织高效渗透：宏观（3–5 mm组织片）中位渗透深度4.0 mm（IQR 2.4–5.1），显微（4 µm切片）中位2.4 mm（IQR 1.9–4.5）。
讨论与结论总结：
研究人员通过合理设计改良此前探针，以环己硫酮环提升溶解度与对微环境小pH变化敏感性，使PH10在酸性TME与癌细胞溶酶体内发生电子密度分布改变与分子内猝灭快速降低，从而在小鼠1分钟、人标本10分钟内实现高TBR结直肠癌检测；PH10保留OATP亲和性，可高效扩散入肿瘤组织，因pH响应性（而非单纯蓄积）获得近两倍pH 5.0相对pH 7.4荧光强度，并实现快速且持久实时成像，克服可激活荧光探针需长等待与短成像窗等局限。与需静脉给药的pH纳米探针及可见光谱酶激活局部探针相比，PH10集合小分子NIR读出、局部给药、1分钟内激活、足够滞留与实时可视化，更具术中肿瘤成像相关性。在临床中，FME可提升nCRT后疗效评估以筛选W&W患者，FGS可助完整肿瘤切除；局部应用可激活成像制剂在患者流程、安全性与成本效益上具有优势，且PH10离体人类结直肠癌中位TBR 2.2高于可视化所需最小阈值1.5。荧光信号与Ki-67（肿瘤细胞增殖与活力标志，非酸性条件替代）相关，表明PH10更适合检测高增殖侵袭性肿瘤。82%样本TBR≥1.5，500 µM组全部TBR≥2.0（动物提示250 µM亦充足），未来研究可采用250–500 µM起始浓度；盐水清洗必要（1分钟内）以提升TBR，且PH10在人组织渗透深度4 mm足以检测黏膜下肿瘤；差异来自固定后组织收缩等。研究局限包括：因病理流程未能用直肠癌标本（极少术前新辅助治疗）、宏观肿瘤阳性区勾画引入变异、概念验证未涵盖全面生物相容性/毒理学/光毒性与扩展稳定性、切片时间可能高估渗透深度但广泛清洗后风险低，且术前去除血液黏液可能高估体内渗透。后续步骤包括PH10的GMP生产、毒理学测试及I/II期临床试验（健康志愿者与人造水疱测试安全性与创面愈合；直肠癌患者术中FME或FGS腔隙应用测试安全性与检测残留肿瘤可行性）。结论：PH10是一种有前景、起效快的局部NIR制剂，用于结直肠癌内镜与手术期间实时肿瘤检测；其简易性与快速动力学支持潜在临床转化，且pH可激活机制可扩展至其他具酸性微环境实体癌。
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