利用新型生物发光成像技术揭示小鼠持续存在的疼痛状况

作者：Subo Yuan、Jia Yi Liew、Ajay Pal、Jigong Wang、Yixuan Zhou、Dustin P. Green、Massoud Motamedi、Shao-Jun Tang

单位：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部神经生物学系，邮编77555

摘要

在实验室动物中客观测量疼痛对于疼痛研究和镇痛剂开发至关重要。尽管已经开发出多种行为测试来测量动物模型中的诱发性疼痛，但测量自发性疼痛仍然具有挑战性。为了解决这一需求，我们开发了一种新的成像方法来检测动物疼痛模型中的自发性伤害感受。为此，我们构建了一种细菌人工染色体转基因小鼠，该小鼠在鼠突触素1启动子下表达Redquorin蛋白。Redquorin是一种融合蛋白，由番茄荧光蛋白（tdTA）的两个串联二聚体组成，在共胞藻素存在的情况下，从激活的神经元中发出长波生物发光。这种发光可以穿透组织并在体表形成图像，可以通过体内成像系统（Spectrum In Vivo Imaging System）检测到，从而实现伤害感受神经元活动的成像。我们使用tdTA小鼠来观察由辣椒素、HIV-1包膜糖蛋白gp120以及脊髓神经结扎引起的自发性疼痛的生物发光现象。结果表明，Redquorin发出的生物发光是一种敏感的自发性疼痛测量方法。这种方法为基础研究和转化研究提供了测量动物模型中自发性疼痛的新途径。

观点

本文介绍了一种基于钙依赖性生物发光的非侵入性成像技术，用于可视化小鼠的疼痛。由于该方法依赖于非反射性的疼痛测量，因此有可能用于高通量镇痛剂筛选。

引言

慢性疼痛是一种高度主观且令人不适的感觉，其病理机制涉及体感神经系统中的复杂变化。根据美国疾病控制与预防中心（2021年数据），21%的成年人患有慢性疼痛，其中7%的人经历着高影响的慢性疼痛。然而，只有30%的患者得到了适当的治疗。尽管对疼痛研究的投资不断增加，但具有理想疗效的新镇痛剂仍然有限。许多候选药物在动物模型中显示出有效的镇痛效果，但在临床试验中却失败了。其中一个原因可能是实验性疼痛测量主要关注诱发性疼痛，而非自发性疼痛，而自发性疼痛是患者慢性疼痛的自然组成部分。这种动物研究与人类疼痛之间的差异凸显了开发新的方法来测量动物模型中自发性疼痛的必要性。

动物疼痛模型的建立旨在复制临床疼痛表型、探索疼痛机制并评估潜在药物的有效性。虽然动物模型中通常使用反射行为测试（如von Frey测试）或温度刺激来测量诱发性疼痛，但评估自发性疼痛的方法有限且耗时。测量诱发性疼痛容易受到实验者偏见的影响，并可能受到人-动物互动的干扰。通过最小化实验者的干预来测量疼痛可以显著减少这些干扰因素。因此，对于基础研究来说，一个能够测量镇痛剂对自发性疼痛影响的平台是非常必要的。

疼痛处理神经元的激活会提高细胞内Ca²⁺水平，这为使用钙信号作为伤害感受的生物标志物提供了机会。细胞内Ca²⁺水平的升高可以通过荧光蛋白aequorin来监测，aequorin通过生物发光共振能量转移（BRET）机制发出光子。实际上，基于aequorin的方法已被用于监测多种生理过程。在这项研究中，我们试图开发一种基于aequorin的策略来监测动物模型中的自发性疼痛。我们构建了一种转基因小鼠，该小鼠在鼠突触素1启动子（mSyn1）的控制下表达一种名为Redquorin的融合蛋白。由于疼痛刺激导致的细胞内Ca²⁺升高，aequorin会被激活，从而通过BRET机制使tdTA发出长波红光。这种长波光可以穿透组织，并通过体内成像系统（IVIS）捕捉到，从而实现脊髓背角（SDH）、背根神经节（DRG）和神经中的伤害感受信号的可视化。因此，这些携带tdTA的小鼠成为伤害感受神经元活动成像（NNAI）的新工具。

我们在tdTA小鼠中建立了三种不同的疼痛模型，并使用IVIS成像仪测量了脊髓区域的光子发射情况。我们的数据证明了这一策略的概念及其在啮齿动物模型中测量自发性疼痛的应用。

章节片段

鼠突触素1启动子（mSyn1）Redquorin（tdTA）转基因小鼠

我们构建了一种含有荧光蛋白tdTA的融合蛋白，并将其置于mSyn1启动子下，以限制其在神经元中的表达。aequorin是一种钙激活的光敏蛋白，与Ca²⁺结合时会发出蓝光。经过改造的tdTA通过BRET作用使发射光波长从蓝光变为575纳米的红光，这种红光能够穿透皮肤和其他组织，且光子散射较少。

这些转基因小鼠是通过细菌人工染色体（BAC）技术制备的。

含有Redquorin构建的tdTA小鼠的制备

我们设计了一种光学成像策略，通过监测小鼠模型中疼痛回路中的伤害感受神经元活动来测量自发性疼痛。为此，我们构建了一种转基因小鼠，以实现伤害感受神经元活动的光学成像。aequorin是一种对Ca²⁺敏感的荧光蛋白，已被用于监测多种生物过程中的Ca²⁺升高。然而，由于实验性疼痛测量主要关注诱发性疼痛而非自发性疼痛……

讨论

疼痛机制研究的一个挑战是使疼痛可视化。我们的目标是开发一种能够无创地检测由伤害感受引起的神经元Ca²⁺升高的报告基因小鼠，利用Ca²⁺作为伤害感受的代理指标。通过将Redquorin与CLZ重组并表达在tdTA中，我们获得了高信噪比的全身图像，从而可以在体外光学光子通量与体内精确的Ca²⁺水平之间建立联系。

资助

本研究得到了德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部妇女健康跨学科研究中心、Sealy衰老研究中心和Claude D. Pepper老年人独立中心（P30 AG024832）以及NINDS R01NS122571（SY）的资助，同时还获得了NIH的R01NS079166、R01DA057195、R01DA050530（SJT）和NINDS R01NS131507（DPG）的资助。

CRediT作者贡献声明

SY：负责手稿的起草、修订和最终定稿，生物发光成像策略和实验设计，以及大部分实验的实施、数据收集、分析和解释。JL：负责实验操作。AP：参与实验。JW：负责SNL小鼠的手术操作。YZ：参与实验。DG：监督行为测试。MM：监督IVIS成像。SJT：负责项目的概念构思、tdTA小鼠的构建和手稿修订。所有作者均已阅读并同意当前版本。

利益冲突

所有作者均声明与本研究内容无任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢Igor Patrikeev博士在BLI成像方面的协助；La Jun-Ho博士和Jin Mo Chung博士在SNL手术方面的支持；以及Sarah Toombs Smith博士对手稿的审阅和编辑工作。