过氧化氢（H2O2）是线粒体代谢过程中产生的关键活性氧分子，在信号传递、免疫防御和代谢调节中起着重要作用[1]、[2]、[3]。作为细胞能量代谢的中心场所，线粒体通过电子传递链和超氧化物歧化酶（SOD）不断产生H2O2，这些过程参与信号转导、免疫反应和氧化还原稳态的调节[4]、[5]、[6]。然而，当线粒体抗氧化系统（如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶）功能失调时，H2O2在线粒体内的异常积累会引发氧化应激，导致线粒体功能障碍和DNA损伤，这与某些病理过程密切相关[7]、[8]、[9]、[10]。此外，粘度作为关键的微环境参数，在生理功能中起着重要的调节作用，例如影响物质的内部运输和酶活性[11]、[12]。线粒体粘度的异常变化会加剧氧化应激损伤并导致突变，这与炎症、神经系统疾病甚至癌症有关[13]、[14]、[15]。研究发现，过量的H2O2不仅会直接导致线粒体结构损伤，还会通过改变线粒体基质的粘度干扰代谢物运输和酶反应，进一步放大病理效应[16]、[17]、[18]。因此，开发实时监测线粒体H2O2和粘度变化的分析方法对于揭示H2O2/粘度与线粒体相关疾病之间的关联具有重要意义。
近年来，基于荧光成像技术的分子探针因其高灵敏度、出色的时空分辨率和非侵入性，已成为解析亚细胞器微环境参数或生物活性分子的关键工具[19]、[20]、[21]。最近，已经开发出几种用于单独检测粘度和H2O2的优秀荧光探针[22]、[23]、[24]、[25]。然而，这些探针仍无法用单一探针同时实现粘度和H2O2的双重成像，这极大地限制了它们在研究生物系统中粘度和H2O2相互作用中的应用。目前，已经报道了许多出色的双功能探针，可以同时检测线粒体粘度和H2O2，为揭示H2O2与粘度之间的相互作用机制提供了新的方法[26]、[27]、[28]、[29]。然而，大多数这类双参数探针仍存在显著的技术瓶颈。大多数探针依赖于线粒体膜电位（MMP）进行定位，但线粒体膜电位在病理条件下容易波动，这可能导致探针泄漏并产生错误的检测信号[30]。因此，开发不依赖于膜电位的线粒体靶向H2O2/粘度双参数探针迫在眉睫。这类探针的开发将显著提高研究线粒体氧化还原稳态与粘度动态相互作用的精度，为阐明疾病机制提供强有力的工具。
在这项研究中，我们开发了一种双响应探针（BKI），能够检测线粒体粘度和H2O2。BKI对粘度和H2O2具有高灵敏度、良好的生物相容性和高稳定性。值得注意的是，BKI可以独立于MMP稳定地定位在线粒体内。利用这种稳健的探针BKI，我们成功检测到了线粒体粘度的动态变化以及内源性和外源性H2O2的影响。更重要的是，使用这种探针，我们检测到癌症患者肿瘤组织中H2O2水平升高和粘度增加。这些结果不仅验证了BKI在复杂临床样本中的实际应用价值，还为H2O2积累、线粒体粘度升高与肿瘤进展之间的密切关联提供了直接的体内证据。
BKI的合成过程在Scheme S1中有详细说明。化合物2和BKI的特性在支持信息（Figs. S1-S6）中给出。
将BKI（5 mM）储备液溶解在DMSO中。用于光谱实验的BKI浓度为10 μM，激发波长为405 nm。
Fadu细胞在培养箱（37°C，5% CO2）中培养24小时后进行实验。BKI的细胞毒性通过MTT测定法进行评估。
本研究中使用的新鲜组织样本来自山东省耳鼻喉医院病理科。本研究已获得山东省耳鼻喉医院伦理委员会的批准（XYK20211107）。
新鲜组织在37°C、5% CO2的培养箱中与BKI（10 μM）共培养30分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并通过共聚焦显微镜成像。
