多倍体化（polyploidy）及其后续的后多倍体二倍化（post-polyploid diploidization, PPD）是驱动植物演化与适应的关键力量，然而古异源多倍体（paleo-allopolyploid）在这些谱系适应极端环境过程中的基因组机制仍不清楚。本研究以银叶树（Heritiera littoralis, 锦葵科）为研究对象，该物种由约6000万年前形成的古异源四倍体（paleo-allotetraploid）演化而来。研究人员通过从头染色体水平基因组组装重建了PPD的演化动态。该古异源四倍体（n = 22）通过六次染色体重排事件（包括三次融合和三次相互易位）演化为银叶树（n = 19）。其中两次重排事件为银叶树所特有，解释了Heritiera属与Firmiana属之间的染色体分化，凸显了下降性非整倍性（descending dysploidy）在银叶树种化中的作用。通过重建演化轨迹，研究人员将银叶树基因组划分为A和B两个亚基因组，发现B亚基因组保留了更多基因并在长期PPD过程中表现出持续的表达优势（expression dominance）。值得注意的是，超过85%的盐分响应基因为PPD保留的重复基因，基因分馏（gene fractionation）、亚功能化（sub-functionalization）和新功能化（neo-functionalization）共同塑造了一个胁迫适应性基因调控网络。本研究通过阐明古多倍体化在极端环境中的适应作用，推进了古多倍体研究，并强调了其对植物长期演化的重要意义。
银叶树（Heritiera littoralis）是广泛分布于印度-西太平洋区域的典型红树林物种，具有重要的生态学意义，被称为"镜面红树"（looking-glass mangrove）。作为锦葵科（Malvaceae）梧桐亚科（Sterculioideae）的代表性物种，银叶树不仅是解析锦葵科演化历史的关键模型，更因其独特的生态生理适应性成为研究植物极端环境适应的重要材料。该物种具有板状根以提供潮间带生境中的结构支撑，其繁殖体具有纤维质中果皮以适应海水传播和远距离扩散。尤其重要的是，银叶树被认定为盐分超排斥型（salt hyper-excluder），能在高盐条件下维持低叶片Na⁺浓度和低Na⁺/K⁺比值。
锦葵科是一个多样性丰富、兼具经济与生态重要性的被子植物类群，包含约4225个物种，分属10个亚科。系统发育上，这些亚科分为两大支系：Byttneriina支系（包括Byttnerioideae和Grewioideae）和Malvadendrina支系（包括Bombacoideae、Brownlowioideae、Dombeyoideae、Helicteroideae、Durionoideae、Malvoideae、Sterculioideae和Tilioideae）。近期研究全面重建了锦葵科的演化历史，证明网状异源多倍体化（reticulate allopolyploidy）在该科的演化和多样化中发挥了关键作用。其中，Malvadendrina支系的梧桐亚科等四个亚科起源于约6000万年前A、B两个祖先基因组杂交形成的古异源四倍体（AABB, n = 22）。
尽管多倍体化作为普遍的演化驱动力已被广泛认识，但古异源多倍体的精确识别及其亚基因组的划定仍具挑战性，这主要源于PPD过程中下降性非整倍性和大规模染色体重排导致的亚基因组广泛混杂，以及差异性的基因保留与分馏进一步模糊了祖先基因组结构。先前关于多倍体基因组演化的研究主要集中于新多倍体（neo-polyploid），对古多倍体尤其是古异源四倍体的长期基因组演化轨迹认识仍十分有限。银叶树作为源自该古异源四倍体的红树物种，为解析长期多倍体化后果和亚基因组演化提供了理想系统。
研究人员针对采自珠海淇澳岛的单一个体，整合了PacBio HiFi长读长测序、Illumina短读长测序和Hi-C染色质构象捕获技术，构建了高质量的染色体水平基因组。通过K-mer频率分布分析估计基因组大小约为903 Mb，最终组装出873.3 Mb的染色体水平基因组，92.5%的序列锚定并定向到19条假染色体上，与先前报道的染色体数目一致。组装质量经多项独立指标严格验证：Merqury质量值（QV）达57.8，k-mer完整性为93.95%，短读长比对率为99.0%，BUSCO完整性评分达98.7%，平均LTR组装指数（LAI）为20.31，各项指标均优于先前发表的银叶树属基因组。
基因组注释揭示GC含量为34.65%，转座元件（transposable elements, TEs）占组装序列的62.28%，其中长末端重复反转座子（LTR-RTs）最为丰富（53.71%）。共预测到27,999个蛋白编码基因，其中1,693个为转录因子，分属57个家族，以MYB家族最为丰富。
在染色体演化分析中，研究人员基于端粒中心模型（telomere-centric model）解析了从祖先到现生银叶树的八次大规模染色体间重排事件，划分为四个演化阶段：第一阶段，RCT1和RCT2事件发生于A基因组祖先，可能驱动其与其他Malvadendrina祖先的分歧；第二阶段，A基因组祖先（Pr1A–Pr11A）与B基因组祖先（Pr1B–Pr11B）杂交形成异源四倍体AABB（n = 22），随后NCF1事件使染色体数目减至n = 21；第三阶段，RCT3、RCT4和EEJ事件为梧桐亚科两个受试物种所共享，其中EEJ事件进一步将染色体数目减至n = 20，该状态保留于Firmiana major中；第四阶段，RCT5和NCF2为银叶树特有事件，NCF2使染色体数目降至现存的n = 19。通过与Firmiana major的比较，研究人员确认两次额外的重排事件为银叶树所特有，其中NCF2事件直接解释了Heritiera属（n = 19）与Firmiana属（n = 20）之间的染色体数目差异。
基于染色体演化轨迹和系统发育分析，研究人员将银叶树基因组相位划分为A和B两个亚基因组，共鉴定出20,025个PPD保留基因，其中A亚基因组9,277个，B亚基因组10,748个。约半数保留基因为单拷贝：A亚基因组4,156个，B亚基因组5,627个，另有5,121个双拷贝保留被 designate为同源基因对（homoeologous gene pairs）。表达分析表明，单拷贝保留基因的表达水平低于双拷贝保留基因，且基因沉默比例更高，这可归因于单拷贝保留基因上放松的纯化选择使其更易在PPD过程中发生沉默和随后的基因组丢失。
亚基因组表达分化分析揭示B亚基因组表现出明显的亚基因组优势：在总基因和单拷贝基因中，B亚基因组均表现出更高的表达水平趋势；在同源基因对中，B亚基因组在三种组织中均显示出显著更高的平均表达水平，且B偏倚同源基因（B-biased homoeologs）数量在所有受检组织中均超过A偏倚同源基因。这为银叶树的亚基因组优势提供了明确证据。
研究人员进一步探究了影响同源基因表达分化的因素。基于叶片表达谱，将5,121对PPD保留同源基因对分为四类：631个沉默型、1,962个平衡型、1,261个A偏倚型和1,267个B偏倚型。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，平衡型同源基因主要富集于核心持家过程，而偏倚型同源基因表现出明确的功能分化证据，A偏倚和B偏倚同源基因分别具有大量特异的GO术语。基因组特征分析揭示，沉默型同源基因具有最高的GC含量和最短的 intron 长度，而偏倚型同源基因的优势拷贝通常具有更长的intron。DNA甲基化分析表明，沉默型同源基因的mCHG和mCHH甲基化水平高于表达型同源基因，而mCG甲基化水平较低；对于亚基因组偏倚同源基因，优势表达拷贝的基因体甲基化水平显著较低，证实了DNA甲基化在古多倍体亚基因组优势调控中的作用。
为解析盐分胁迫响应机制，研究人员对24株采自海南东寨港国家级自然保护区苗圃的银叶树幼苗进行了时间梯度盐处理实验（0时间点至7天）。转录组分析显示，叶片和根系对盐胁迫表现出显著差异的响应模式：叶片经历更为剧烈的转录组重编程，共鉴定出4,646个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），远高于根系的2,908个；根系DEGs随时间呈现明显的分阶段聚集模式。GO富集分析表明，叶片DEGs显著富集于膜相关生物学过程和刺激响应，而根系DEGs富集于应激响应、离子结合和激素响应等。
k-means聚类分析将DEGs分为八个表达簇，揭示了组织特异性的动态响应模式。叶片中，持续下调的基因簇富集于叶绿体相关组分和光合作用过程，表明盐处理持续抑制光合活性；12小时达峰的表达簇富集于应激响应、激素响应和信号转导；后期达峰的表达簇则富集于渗透应激响应、盐胁迫耐受以及脱落酸（abscisic acid, ABA）和茉莉酸（jasmonic acid, JA）信号通路。根系中，早期响应基因簇富集于细胞对生长素刺激的反应和根发育过程，而晚期响应基因簇主要与逆境胁迫抗性和植物激素介导的信号传导相关。
加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定出12个共表达模块，其中MEturquoise模块包含最大基因集（n = 1,744），显著富集于ABA和JA信号通路的核心调控组分，包括22个PYR/PYL/RCAR受体家族成员、4个蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因和18个蔗糖非发酵1相关蛋白激酶（SnRK）。模块中前10个连接度最高的枢纽基因（hub genes）包含2个RCAR、2个PP2C、5个SnRK和1个JAZ基因，另有20个属于MYB、bHLH、DBB和WRKY家族的枢纽转录因子，共同构成了银叶树盐胁迫响应的核心调控网络。
全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）揭示盐处理后整体甲基化水平与对照相当，但TE区域的mCHH甲基化水平升高。共鉴定出15,178个差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs），主要发生于CHH上下文，其中3,520个DMRs与启动子或基因体重叠，对应2,908个差异甲基化基因（differentially methylated genes, DMGs）。然而，单个基因位点的DMRs与基因表达模式之间未观察到一致性关联，表明DNA甲基化并非盐胁迫下转录调控的唯一决定因素。
PPD保留基因与盐胁迫响应的关联分析是本研究的核心发现之一：89.4%的叶片DEGs和86.1%的根系DEGs来源于PPD保留基因，显著高于PPD保留基因在基因组中的占比（71.5%）。A、B两个亚基因组在盐胁迫下呈现相似的表达谱，但1,801个叶片DEHs和1,162个根系DEHs中仅25%的两个拷贝均被鉴定为DEGs，表明同源基因对之间存在广泛的功能分化。代表性基因组区域分析揭示了PPD保留基因在盐胁迫下的多样化表达模式：某些同源基因表现出协同表达，而另一些则表现出显著的分歧表达，如Chr16_1874在根和叶中7天处理后均显著上调，而其同源拷贝Chr15_3156在叶中无显著差异表达、在根中则持续沉默。
讨论部分，研究人员系统总结了该研究的理论贡献与科学意义。首先在染色体演化层面，研究完整重建了银叶树从古异源四倍体祖先（AABB, n = 22）到现代二倍化核型（n = 19）的染色体演化轨迹，鉴定了八次大规模染色体重排事件，其中NCF2事件直接导致了Heritiera属与Firmiana属的染色体数目差异，为下降性非整倍性驱动物种分化提供了明确证据。其次在亚基因组演化层面，研究证实B亚基因组在长期PPD过程中保持了更多的基因保留和持续的表达优势，遗传和表观遗传因素共同贡献了这一亚基因组优势的维持，与新兴的全基因组亚基因组研究共同支持一个普遍模式：亲本谱系间的遗传分歧在杂交后即产生即时的亚基因组优势，并能持续数千万年塑造基因组演化。最后在环境适应层面，研究首次将古异源多倍体化的基因组变异与长期PPD过程以及极端环境适应联系起来，明确了PPD保留基因在红树盐胁迫适应中的关键作用，填补了先前红树研究缺乏亚基因组解析和核型演化视角的关键空白。
研究结论部分指出，本研究呈现了古异源四倍体祖先衍生的红树物种银叶树的高质量染色体水平基因组组装，补充了先前锦葵科多倍体研究。研究全面分析了该独特谱系中PPD驱动的基因组演化，澄清了现有研究中三个关键不足：（1）银叶树谱系特异性染色体重排（如NCF2事件）是Malvadendrina支系内核型分化的基础；（2）古异源四倍体PPD过程中亚基因组优势的长期稳定性及其调控机制（基因保留偏倚、表达分歧）；（3）PPD保留基因在极端潮间带环境中介导盐胁迫适应的关键作用。该研究通过多组学整合，独特地将古异源四倍体杂交产生的基因组变异与长期PPD过程以及极端环境适应联系起来，推进了对古异源多倍体在红树演化成功中作用的理解，为解析古代杂交谱系中PPD介导的适应机制提供了宝贵案例。未来对关键PPD保留盐分响应基因的功能表征以及古异源四倍体红树的跨谱系比较，将进一步揭示多倍体驱动的极端适应的普遍性和谱系特异性机制。
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