叶施纳米氧化铈颗粒（CeO₂ NPs）通过调控萜类生物合成基因表达缓解Salvia mirzayanii的干旱胁迫。该研究评估了0–1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs在干旱（25–100%田间持水量，FC）及复灌条件下对1,8-桉叶油素合酶（1,8-Cineole Synthase, CS）和芳樟醇合酶（Linalool Synthase, Lis）基因的影响，采用析因完全随机区组设计（factorial RCBD）。通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分析CS、Lis及内参基因GAPDH的表达；基于mRNA和蛋白质序列进行CS与Lis基因的系统发育关系分析。方差分析（ANOVA）显示干旱、CeO₂ NPs与复灌存在显著的三方交互作用（P < 0.01）。在严重干旱（25% FC）下，1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs叶施处理在复灌期最大化基因表达，与对照相比CS上调2.51倍、Lis上调2.73倍。复灌通常降低表达量，低于胁迫峰值。扫描电镜（SEM）证实叶片表面球形纳米颗粒（10–30 nm）的积累。系统发育分析将S. mirzayanii与Lavandula spp.聚为一支，CS基因遗传相似性达0.846–0.853。上述结果证实CeO₂ NPs可作为有效的纳米诱导子（nano-elicitors），通过特异性转录调控萜类合酶基因增强抗旱性。
干旱胁迫是影响全球约52%陆地面积的最常见环境胁迫因子，严重制约植物生长发育与农业产量。药用植物Salvia mirzayanii为唇形科多年生或二年生草本，原产于伊朗，富含萜类等次级代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗焦虑等多种药用价值。然而，干旱胁迫会显著影响该物种的分布与次生代谢物积累。近年来，纳米技术因其在农业领域的应用潜力受到广泛关注，其中纳米氧化铈颗粒（CeO₂ NPs）因具有类似过氧化氢酶（catalase）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的抗氧化特性，能够通过清除羟基自由基和一氧化氮来缓解植物氧化损伤，已成为一种潜在的纳米肥料和胁迫缓解剂。尽管CeO₂ NPs在多种作物中展现出促进生长、增强抗旱性的效果，但其在药用植物萜类生物合成调控方面的分子机制尚不明确。特别是1,8-桉叶油素合酶（CS）和芳樟醇合酶（Lis）作为单萜生物合成的关键酶，其基因表达对干旱胁迫具有显著响应，但CeO₂ NPs如何调控这些基因以缓解干旱胁迫的机制仍有待研究。基于此，研究人员开展了该项研究，旨在探索CeO₂ NPs对S. mirzayanii中CS和Lis基因表达的影响及其生物信息学特征，为理解纳米材料调控药用植物次级代谢的分子机制提供新视角。该论文发表于《Plant Nano Biology》。
研究人员采用伊朗森林与-range研究所（RIFR）提供的种子，于2019–2020年开展实验。实验设计采用三因素析因完全随机区组设计，因素包括：干旱胁迫（25%、50%、75%、100% FC四个水平）、CeO₂ NPs叶施浓度（0、125、250、500、1000 mg·L⁻¹五个水平）以及复灌处理（非复灌与复灌两个阶段），共300盆，每处理3次重复。CeO₂ NPs为市售球形纳米颗粒（伊朗Nano-Sany公司产品，纯度99.97%，粒径10–30 nm），其理化性质通过X射线衍射（XRD）、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）表征确认。总RNA提取采用改良的异硫氰酸胍-醇沉淀法，经DNase I处理后，选取260/280比值大于1.9且浓度超过100 ng·µL⁻¹的样品进行后续分析。基因表达分析采用SYBR Green染料法的实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR），以GAPDH为内参基因，2
-ΔΔCT 法计算相对表达量。引物设计基于NCBI数据库中CS、Lis及GAPDH基因的保守区域，使用Oligo7软件设计并经过Primer-BLAST验证。系统发育分析基于mRNA和蛋白质序列，采用Clustal W算法比对，邻接法（Neighbor Joining, NJ）构建系统发育树，遗传距离矩阵计算使用MEGA软件。统计分析采用SAS软件进行方差分析，Duncan多重比较检验均值差异显著性。
**3.1 RNA电泳与扩增曲线**
琼脂糖凝胶电泳结果显示提取的RNA样品具有清晰的18S和28S核糖体RNA条带，RNA完整性指数（RIN）为7.9–9.2，浓度256.9–366.8 ng·µL⁻¹，OD
260/280 为1.85–2.01，表明RNA质量满足后续基因表达分析要求。
**3.2 方差分析**
方差分析结果表明，干旱胁迫、CeO₂ NPs、复灌及其双因素和三因素交互作用对CS和Lis基因的相对表达水平均有极显著影响（P < 0.01），干旱胁迫的主效应最为显著（CS: F = 9.73, Lis: F = 9.98），CeO₂ NPs浓度（CS: F = 1.09, Lis: F = 0.05）和复灌（CS: F = 1.67, Lis: F = 2.1）也达到显著水平。三方交互作用（干旱 × 纳米 × 复灌）对CS和Lis基因表达的影响均极显著（P < 0.01），表明纳米效应依赖于干旱程度和复灌状态的共同调控。
**3.3 相对基因表达**
基因表达分析结果显示，复灌处理相对于胁迫峰值降低了基因表达水平。在严重干旱（25% FC）条件下，CeO₂ NPs处理显著提高了两个萜类合酶基因的表达。
对于CS基因，在复灌阶段，1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs处理在严重（25% FC）、中度（50% FC）和轻度（75% FC）干旱下分别较对照上调2.51倍、2.06倍和0.46倍；非复灌阶段，25%、50%和75% FC干旱水平下分别上调1.11倍、1.88倍和0.22倍。500 mg·L⁻¹与1000 mg·L⁻¹处理间无显著差异。
对于Lis基因，复灌阶段1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs处理在25%、50%和75% FC干旱下分别较对照上调2.73倍、2.25倍和0.50倍；非复灌阶段则分别上调2.16倍、1.92倍和0.22倍。500 mg·L⁻¹和1000 mg·L⁻¹浓度下Lis表达水平最高。
**3.4 CeO₂ NPs的吸收**
SEM观察证实CeO₂ NPs能够渗透进入叶片组织，高浓度处理导致纳米颗粒在气孔细胞周围发生聚集和累积，低浓度和高浓度处理均可见明显的白色斑点状纳米颗粒分布。
**3.5 基于1,8-桉叶油素合酶序列的系统发育聚类分析**
基于mRNA和蛋白质序列的系统发育分析表明，1,8-桉叶油素合酶基因在植物中分为两大分支和七个亚分支。S. mirzayanii与Lavandula angustifolia及Lavandula latifolia聚于同一分支，显示出最高的系统发育亲缘关系；而Arabidopsis thaliana、Nicotiana suaveolens和Citrus unshiu则处于最远分支。
**3.6 1,8-桉叶油素合酶基因的遗传距离**
基于DNA序列的遗传距离分析预测了不同植物品种的遗传多样性和杂合度。Lavandula latifolia（0.846）和Lavandula angustifolia（0.853）与S. mirzayanii的遗传相似性最高；基于蛋白质序列的分析同样证实Lavandula angustifolia（0.282）和Lavandula latifolia（0.282）具有最高的遗传相似性。
**3.7 1,8-桉叶油素合酶基因的嘌呤和嘧啶转换率**
嘌呤和嘧啶碱基转换率分别为：A→G（15.24）、G→A（10.62）、T/U→C（15.14）、C→T/U（11.14）。
**3.8 1,8-桉叶油素合酶基因的核苷酸碱基对频率**
不同物种间核苷酸频率存在差异：Nicotiana suaveolens质体中T（U）频率最高，Picea sitchensis和Picea engelmannii中C频率最高，Nicotiana suaveolens质体中A频率最高，Citrus unshiu中G频率最高。
**3.9 1,8-桉叶油素合酶基因的氨基酸频率**
氨基酸频率在不同品种间差异显著。S. mirzayanii中丝氨酸（Serine, 7.6271%）和丙氨酸（Alanine, 7.4576%）频率最高；其他品种如Arabidopsis thaliana富含半胱氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和赖氨酸，Lavandula angustifolia富含谷氨酰胺，Perilla frutescens富含甘氨酸。
**3.10 基于芳樟醇合酶序列的系统发育聚类分析**
基于mRNA和蛋白质序列的芳樟醇合酶系统发育分析显示，该基因分为两大分支和15个亚分支。Clarkia concinna单独聚为一支，表现出最高的系统发育关系；而Salvia miltiorrhiza、Lavandula × intermedia、Mentha citrata、Perilla citriodora和Perilla frutescens的亲缘关系最远。
**3.11 芳樟醇合酶基因的遗传距离**
基于DNA序列的遗传距离分析显示，S. mirzayanii与Perilla frutescens（0.196）、Perilla citriodora（0.206）、Mentha citrata（0.256）、Lavandula × intermedia（0.316）的遗传相似性最高；基于蛋白质序列的分析结果相似，分别为0.247、0.263、0.301和0.420。
**3.12 芳樟醇合酶基因的嘌呤和嘧啶转换率**
转换率为：A→G（11.06）、G→A（14.97）、T/U→C（11.71）、C→T/U（16.46）。
**3.13 芳樟醇合酶基因的核苷酸碱基对频率**
不同物种核苷酸频率差异显著：Taiwania cryptomerioides中T（U）频率最高，Wurfbainia villosa中C频率最高，Solanum lycopersicum质体中A频率最高，Lavandula × intermedia中G频率最高。
**3.14 芳樟醇合酶基因的氨基酸频率**
S. miltiorrhiza中亮氨酸（Leucine, 11.312%）以及谷氨酰胺和丝氨酸（7.7807%）频率最高。各物种特征性高频率氨基酸包括：Perilla frutescens的丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸，Freesia hybrid的半胱氨酸，Citrus unshiu的天冬酰胺，Mentha citrata的苯丙氨酸，Picea sitchensis的甘氨酸，Wurfbainia villosa的精氨酸，Taiwania cryptomerioides的苏氨酸，Clarkia concinna的脯氨酸，Perilla citriodora的谷氨酰胺，Rosa chinensis的丝氨酸，以及Vitis vinifera的组氨酸、缬氨酸和色氨酸。
讨论部分，研究人员首先阐述了干旱胁迫与萜类合酶基因表达的关系。研究结果显示，与正常条件相比，干旱胁迫显著上调了CS和Lis基因的表达，且表达上调幅度与干旱胁迫程度呈正相关，在极端干旱条件下达到最高。CS和Lis基因分别上调45%和51%，与此前药用植物研究结论一致，即干旱胁迫能够促进药用植物次级代谢产物合成相关基因的表达。CS基因作为鼠尾草属植物关键的单萜合酶基因，编码的CS酶催化前体香叶基焦磷酸（geranyl diphosphate, GPP）转化为终产物1,8-桉叶油素。复灌处理能够通过缓解干旱胁迫的负面影响促进植物恢复，但在严重干旱下CS基因表达仍较对照增加45%。
研究人员进一步分析了CeO₂ NPs缓解干旱胁迫的分子机制。纳米颗粒与植物细胞的互作能够刺激细胞分裂循环、促进次级代谢产物合成，涉及植物激素产生、防御机制上调、氧化还原调控及干旱响应基因激活等多重信号通路。干旱胁迫导致植物细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累和胞质Ca²⁺浓度升高，引发氧化损伤；而纳米颗粒通过细胞膜受体/诱导子结合位点进入细胞，与转运离子形成复合物，增强抗氧化活性，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联反应，调控渗透保护物质积累，并促进一氧化氮等激素和特定转录因子的生物合成。Lis基因表达在干旱处理及复灌后同样增加，严重干旱下较对照增加51%，这与不利生长条件与LIS基因表达正相关的先前研究结论一致。前人研究还显示低温处理10°C下12小时LIS表达可增加4.86倍。
关于CeO₂ NPs对CS和Lis基因表达的特异性调控，研究发现纳米颗粒处理能够上调两个基因的表达，且随浓度增加表达量上升，最高可达对照的12%。CeO₂ NPs与干旱胁迫及复灌联合处理时，两个基因的表达进一步放大。1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs叶施处理下CS和Lis基因表达均值分别达到2.974和2.958，为所有处理最高。这与此前CeO₂ NPs在严重干旱下促进植物生长和代谢的研究结果相符。纳米颗粒作为刺激物的应用日益受到关注，前人研究表明纳米颗粒可提高长春碱、长春新碱、血根碱和迷迭香酸等次级代谢产物合成相关基因的表达。本研究中CeO₂ NPs促进CS和Lis基因表达的结果与此类发现一致。
研究人员指出，纳米颗粒可通过直接激活植物防御反应或间接触发二级信号级联来刺激基因表达，进而影响次级代谢产物的产生和生理反应。目前已有 silver nanoparticles（AgNPs）和iron chelate nanoparticles调控Tanacetum parthenium L.中TpGAS和TpPTS基因表达的报道，表明纳米颗粒在不同胁迫水平下均可增强基因表达。本研究中CeO₂ NPs在水分胁迫条件下调控萜类合酶基因的效果优于无纳米颗粒条件，进一步证实了纳米诱导子（nano-elicitor）的有效性。
系统发育分析揭示了S. mirzayanii与Lavandula属物种的高度亲缘关系，为理解该物种萜类合成途径的进化关系提供了依据。研究人员强调，虽然纳米材料的潜在效应预期通过植物细胞代谢调控介导，但相关观察报道仍不充分，机制尚未完全阐明。未来需进一步解析CS与Lis基因与其他序列的互作及黄酮类生物合成途径中的基因网络，以拓展对酚类生物合成多层面的理解。
研究结论部分原文如下："This study provides the first comprehensive analysis of CeO₂ nanoparticle effects on terpene synthase gene expression in plants under drought stress and recovery conditions. Novel findings demonstrate that 1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs significantly upregulated 1,8-Cineole Synthase (2.51-fold) and Linalool Synthase (2.73-fold) under severe drought (25% FC) during recovery, with ANOVA confirming significant triple interactions (P < 0.01). SEM/TEM analysis revealed nanoparticle accumulation (10–30 nm) around stomatal cells. Phylogenetic analysis identified novel genetic relationships, with Lavandula species showing highest similarity (0.846–0.853) for 1,8-Cineole Synthase, while amino acid frequency analysis revealed species-specific variations in serine (7.62%) and leucine (11.31%) residues. While it is expected that potential effects of nanomaterials are mediated by metabolic regulation in plant cells, observations of this remain partially reported and are not fully understood. Nonetheless, these findings establish CeO₂ NPs as potential drought-stress mitigators through terpene synthase modulation, warranting further mechanistic investigation."
译文：该研究首次全面分析了干旱胁迫与复灌条件下CeO₂ NPs对植物萜类合酶基因表达的影响。创新性发现表明，1000 mg·L⁻¹ CeO₂ NPs在严重干旱（25% FC）复灌期显著上调1,8-桉叶油素合酶（2.51倍）和芳樟醇合酶（2.73倍），方差分析证实了三方交互作用的显著性（P < 0.01）。SEM/TEM分析揭示了纳米颗粒（10–30 nm）在气孔细胞周围的累积。系统发育分析发现了新的遗传关系，Lavandula属物种与1,8-桉叶油素合酶的相似性最高（0.846–0.853），而氨基酸频率分析揭示了丝氨酸（7.62%）和亮氨酸（11.31%）的种属特异性变异。虽然纳米材料的潜在效应预期由植物细胞代谢调控介导，但相关观察报道仍不充分且尚未完全阐明。尽管如此，上述发现确立了CeO₂ NPs通过萜类合酶调控作为潜在干旱胁迫缓解剂的作用，有必要开展进一步的机制研究。
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