赖氨酸（Lysine）乙酰化是一种广泛的翻译后修饰（PTM），可微调细胞生理和代谢，但其在代谢工程中的应用仍未得到充分挖掘。在此，研究人员报道了大肠杆菌（Escherichia coli）乙醛酸支路（glyoxylate shunt）的关键酶异柠檬酸裂合酶（AceA）经历由酶促和非酶促机制介导的可逆赖氨酸乙酰化。研究人员证实乙酰化显著抑制AceA活性。通过结构分析和定点诱变，研究人员确定了关键赖氨酸乙酰化位点，这些位点严重影响酶活性。此外，研究人员开发了一种乙酰化介导的理性设计策略，构建了AceA(S335Q/S398Q)双突变体，与野生型相比，其酶活性提高了2.12倍，并且增强了蛋白质稳定性。该优化的AceA变体在大肠杆菌工程菌株中的应用，通过加强乙醛酸支路和增强碳转化效率，显著提高了一些有价值化学品的产量。该研究阐明了AceA乙酰化的调控机制，并将蛋白质乙酰化确立为一种有前景且通用的工具，用于优化生物生产的代谢途径。
研究背景：
翻译后修饰（PTM）是细胞调控生理代谢的重要机制，其中赖氨酸乙酰化在基因表达、代谢及细胞稳态中具有广泛影响。然而，PTM水平的调控在代谢工程领域尚未受到较多关注。异柠檬酸裂合酶（AceA）催化大肠杆菌乙醛酸支路的第一步反应，能够同化乙酸等简单碳源以合成生物质和目标产物。乙醛酸支路可绕过三羧酸（TCA）循环的两步脱羧反应，减少碳源损耗并补充TCA中间物池，调节该支路有望提高化学品产量和碳原子经济性。尽管已知AceA存在多个赖氨酸乙酰化位点，但乙酰化对大肠杆菌AceA蛋白功能的调控作用仍不清楚。因此，研究人员开展了本研究，旨在阐明AceA的乙酰化机制，并利用该机制进行酶工程改造以优化生物合成。该论文发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》。
主要关键技术方法：
研究人员主要采用分子生物学手段（PCR、限制性内切酶消化、CRISPR及P1 vir介导的转导）进行质粒构建及大肠杆菌BL21(DE3)染色体突变株的构建；利用Ni-NTA柱进行蛋白表达与纯化；通过Western blot（使用抗乙酰赖氨酸单抗及抗His抗体）分析蛋白乙酰化水平及表达量；采用微孔板读数法检测AceA酶活（监测NADH在340 nm的氧化）；通过体外乙酰化（使用乙酰磷酸AcP、乙酰转移酶YfiQ及乙酰辅酶A）与脱乙酰化（使用脱乙酰酶CobB及NAD+ ）实验验证修饰可逆性；结合蛋白结构分析（PDB: 1igw）与定点诱变（将赖氨酸突变为精氨酸R或谷氨酰胺Q）鉴定关键位点；最后通过摇瓶发酵评估工程菌株在合成间苯三酚（PG）、3-羟基丙酸（3HP）和乙酸（glycolate）中的应用效果。
研究结果：
3.1. AceA can be acetylated by nonenzymatic and enzymatic mechanism（AceA可通过非酶促和酶促机制发生乙酰化）：
研究人员通过构建Δpta、ΔackA及其双突变菌株，发现AceA乙酰化水平与乙酰磷酸（AcP）可用性一致，即Δpta和双突变体中乙酰化降低，ΔackA中升高；体外使用AcP处理纯化的AceA，证实乙酰化呈剂量和时间依赖性。此外，体内外实验表明，乙酰转移酶YfiQ可促进AceA乙酰化，而去乙酰化酶CobB（依赖NAD+ ）可逆转该修饰，且可被烟酰胺（NAM）抑制。这表明AceA受非酶促（AcP介导）和酶促（YfiQ介导）双重乙酰化调控，并可被CobB可逆去乙酰化。
3.2. Carbon source affects the acetylation status of AceA（碳源影响AceA的乙酰化状态）：
研究人员发现，在LB培养基中补充葡萄糖或甘油可剂量依赖性提高AceA乙酰化水平（同等浓度下葡萄糖诱导高于甘油），但葡萄糖从1%增至2%未进一步升高。在ΔyfiQ突变株中乙酰化变化与野生型相似，而Δpta-ΔackA双敲除株（AcP合成缺陷）中碳源补充未显著增加乙酰化。AcP和乙酸浓度在Δpta-ΔackA株中明显低于野生型和ΔyfiQ株，且乙酰化水平与AcP和乙酸浓度正相关。这表明碳源依赖的AceA乙酰化主要不依赖于YfiQ，而是依赖于糖酵解通量及代谢物AcP和乙酸的积累（非酶促机制），乙酸积累相关的溢流代谢（overflow metabolism）也与乙酰化正相关。
3.3. Acetylation decreases AceA activity（乙酰化降低AceA活性）：
研究人员测定了经AcP、YfiQ/乙酰辅酶A、CobB/NAD+ 处理后的AceA酶活。结果显示，AcP处理抑制酶活（10 mM AcP处理120 min降至62.6%，20 mM降至54.3%），YfiQ/乙酰辅酶A处理使酶活降低45.4%，CobB/NAD+ 处理使酶活提高1.96倍（NAM抑制CobB后酶活仍为对照1.36倍）。碳源补充引起的乙酰化升高也对应酶活降低。此外，乙酰化对AceA蛋白表达量及稳定性无显著影响。这说明乙酰化无论机制如何均抑制AceA活性，且该翻译后调控可快速可逆地精细调节酶活，无需转录重编程或蛋白降解，调节乙酰化状态可重定向碳流至乙醛酸支路或TCA循环。
3.4. Functional roles of specific lysine acetylation sites of AceA（AceA特定赖氨酸乙酰化位点的功能作用）：
基于大肠杆菌AceA结构（PDB: 1igw）和已发现的11个乙酰化赖氨酸位点，研究人员分析了空间定位，聚焦K193、K201、K326、K331四个候选位点。将各位点分别突变为精氨酸（R，保正电荷、防乙酰化）或谷氨酰胺（Q，中和电荷、模拟乙酰化）后检测酶活：K193Q和K201Q酶活降至野生型20%以下，K326Q和K201R约降至50%，K331突变无显著影响。Western blot证实所有突变体总乙酰化水平均降低。这表明K193和K201所在的高度保守柔性区域（192-200，作为“盖子”）对酶活至关重要，其乙酰化可能通过改变电荷影响构象动态；K326所在区域（318-344）重要性次之；乙酰化通过电性和空间位阻扰动这些关键区域精细调节AceA活性。
3.5. Rational regulation of AceA activity based on acetylation modification（基于乙酰化修饰的AceA活性理性调控）：
鉴于结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶中K331Q/K392Q（对应大肠杆菌AceA的S335/S398）模拟乙酰化可提高酶活，研究人员尝试在大肠杆菌AceA中引入S335K/S398K（促进乙酰化）但未提升酶活，而S335Q/S398Q突变显著提升酶活（双突变体S335Q/S398Q酶活达野生型2.12倍）。动力学分析显示双突变体Vmax 提高1.9倍，Km 相近，催化效率（Kcat /Km ）提升。S335Q/S398Q双突变体蛋白表达量后期超过野生型，且蛋白稳定性显著增强（抑制蛋白合成32 h后保留约89%，野生型仅68%）。这证明基于乙酰化机制的理性设计可获得高活性、高稳定性的AceA变体。
3.6. Applications of AceA acetylation regulation in biosynthesis（AceA乙酰化调控在生物合成中的应用）：
研究人员将AceA及突变体过量表达于生产间苯三酚（PG）、3-羟基丙酸（3HP）和乙酸（glycolate）的工程菌株中。过量表达野生型AceA提升了PG产量（0.65 g/L vs 初始0.51 g/L），而S335Q/S398Q双突变体进一步提升至0.77 g/L（葡萄糖转化效率也最高）；3HP和glycolate生产也呈类似趋势（双突变体glycolate达1.48 g/L，野生型AceA株为0.91 g/L）。S398Q单突变体虽酶活提升，但因蛋白表达量较低，产量未显著优于野生型AceA株。这表明强化乙醛酸支路（尤其是使用优化AceA变体）可有效提高乙酰辅酶A和乙醛酸衍生化学品的产量，通过减少TCA脱羧步骤的碳流失（CO2 ）提高碳原子经济性，该模块可整合至多类化学品合成的底盘菌株中。
讨论与结论：
研究人员系统表征了大肠杆菌AceA的赖氨酸乙酰化机制（非酶促AcP介导和酶促YfiQ介导，均可被CobB可逆脱乙酰化），证实乙酰化抑制其酶活但不影响蛋白稳定性；通过结构分析与定点诱变鉴定了K193、K201、K326等关键调控位点；基于乙酰化模拟（谷氨酰胺替换）开发了S335Q/S398Q双突变体，酶活提高2.12倍且蛋白稳定性增强；该变体在工程菌株中应用显著提高了PG、3HP和glycolate产量及碳转化效率。该研究建立了AceA乙酰化理性调控策略，可优化乙醛酸支路以增强生物合成中的碳转化效率，为利用翻译后修饰洞察进行代谢理性工程设计提供了新范式。
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