在柑橘潜叶蛾（Diaphorina citri）中，针对ATP合成酶β和Actin-α的双链RNA（dsRNA）沉默作用对其死亡率和产卵行为的影响

埃斯梅艾尔·萨贝里（Esmaeil Saberi）|梅里特谢尔·佩雷斯-埃多（Meritxell Pérez-Hedo）|阿尔贝托·乌尔巴内哈（Alberto Urbaneja）|贾瓦德·A·库雷希（Jawwad A. Qureshi）

美国佛罗里达大学，食品与农业科学研究所，昆虫学与线虫学系，西南佛罗里达研究与教育中心，伊莫卡利（Immokalee），佛罗里达州

摘要

亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）是Candidatus Liberibacter asiaticus的传播媒介，这种昆虫导致了全球最具破坏性的柑橘病害——黄龙病（HLB）。RNA干扰（RNAi）作为一种针对特定物种且环保的控制D. citri种群的方法显示出巨大潜力。然而，RNAi控制的成功取决于选择有效的基因靶标和高效的dsRNA递送方式。通过口服蔗糖溶液中的dsRNA，筛选出了四个参与核心生理过程的候选基因。基于其强烈的基因沉默效应，选择了ATP合成酶β和Actin-α两个基因进行进一步研究。通过口服和显微注射方法评估了RNAi的效率及其生物学效应。利用RT-qPCR量化了基因表达，并对这些目标基因的死亡率、产卵情况以及性别差异进行了分析。针对ATP合成酶β和Actin-α的dsRNA口服递送显著提高了成虫死亡率（高达74.8%），并使产卵量减少了61.8%，这表明它们可以作为实际可行的田间应用RNAi策略。值得注意的是，Actin-α在雌性中的表达量高于雄性，这与RNAi效率和生殖输出的性别差异相关。本研究确定了ATP合成酶β和Actin-α作为控制D. citri的有希望的RNAi靶标，并展示了口服dsRNA递送作为一种可扩展且环境安全的策略，有助于减少木虱种群并减轻柑橘作物中的HLB传播。

引言

Diaphorina citri Kuwayama（半翅目：Liviidae），通常被称为亚洲柑橘木虱（ACP），是一种主要的全球柑橘害虫，因为它作为Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）的传播媒介，而后者是黄龙病（HLB，也称为柑橘绿病）的主要致病因子（Wang等人，2017年）。HLB是全球最具破坏性的柑橘病害，严重影响了亚洲、美洲和非洲主要种植区的柑橘生产（Pérez-Hedo等人，2025a）。由于D. citri的快速扩散以及目前尚无治愈HLB的方法，控制该害虫极具挑战性，这导致了巨大的经济损失，并威胁到柑橘生产的长期可持续性。为了减轻其影响，全球范围内实施了综合害虫管理（IPM）策略，包括文化控制、生物控制和化学控制（Qureshi和Stansly 2020；Pérez-Hedo等人，2025a）。然而，除了在佛罗里达州和加利福尼亚州成功引入寄生蜂Tamarixia radiata Waterston（膜翅目：Eulophidae）等少数例外（Qureshi等人2009；Qureshi和Stansly 2019；Hoddle等人2022），大多数地区仍然严重依赖化学处理（Qureshi和Stansly 2009, 2010；Qureshi等人2014）。这种对杀虫剂的过度依赖导致了抗性的产生以及天敌（如捕食者、寄生蜂和昆虫病原体）的减少，进一步复杂化了可持续管理的工作（Qureshi等人2014；Monzo等人2015；Rugno和Qureshi 2024）。鉴于这些挑战，迫切需要开发可持续的替代方法，如RNA干扰（RNAi），它提供了一种有针对性的、环保的方式来控制D. citri，同时保护有益生物并减少对杀虫剂的依赖（Saberi等人2024；Pérez-Hedo等人2025b）。

RNAi代表了一种创新的害虫管理策略，为传统杀虫剂提供了可持续的替代方案。RNAi是一种自然的、进化上保守的机制，通过引入序列特异性的双链RNA（dsRNA）来触发内源基因的靶向沉默（Jain等人，2020）。RNAi的优势包括高特异性、最小的脱靶效应和有限的环境持久性，使其成为减少害虫种群的同时保护有益昆虫的有效方法（Andrade和Hunter，2017）。此外，RNAi技术的最新进展提高了其在害虫控制中的效果，为可持续农业害虫管理提供了有前景的工具。

在过去二十年里，RNAi已成为控制半翅目害虫的潜在方法。然而，RNAi在不同昆虫物种中的效果差异很大（Jain等人，2020；Marques等人，2021）。多种因素影响半翅目昆虫中dsRNA的效率，有时会导致部分或无效的基因沉默。这些因素包括dsRNA降解酶的存在、细胞吸收的挑战、沉默效果的持久性以及昆虫肠道的高pH值，后者可能会降解摄入的dsRNA（El-Shesheny等人，2013；Yu和Killiny，2018）。此外，dsRNA的效率还可能受到递送方法和目标基因的影响（Jain等人，2021）。

实现有效RNAi反应的关键步骤是开发合适且可靠的dsRNA递送方法（Andrade和Hunter，2017；Yu等人，2013）。大多数昆虫RNAi研究采用两种主要递送方法：直接将dsRNA注入血淋巴或通过人工饲料进行口服摄入（Marques等人，2021；Yu和Killiny，2020）。显微注射可以精确地将dsRNA递送到血淋巴或目标组织，避免了在人工饲料中长期暴露导致的降解问题（Killiny和Kishk，2017）。然而，对于大规模应用来说，注射大量昆虫是不切实际的。相反，通过人工饲料进行dsRNA的口服递送是一种更可行且更安全的替代方法，特别是对于早期若虫或幼虫阶段（Tian等人，2009；Killiny和Kishk，2017）。

开发基于RNAi的控制策略的另一个关键步骤是识别在沉默后显著影响昆虫存活的合适目标基因（Andrade和Hunter，2017）。一般来说，参与关键生物过程的基因（如昆虫发育、变态或代谢）是有希望的RNAi靶标（Buer等人，2025）。先前的研究表明，特定D. citri基因的显著敲低会导致发育缺陷、繁殖减少、死亡率增加以及杀虫剂敏感性增强（Yu和Killiny，2020）。

在这项研究中，我们使用显微注射和口服摄入方法递送针对D. citri生物学必需基因的dsRNA，并评估了它们的RNAi介导的效果。我们筛选了四个潜在的RNAi靶标基因，分别是ATP合成酶β、液泡ATP酶（V-ATPase）、actin-α和ADP/ATP转运酶（Gallego-Giraldo等人，2026）。ATP合成酶β是线粒体ATP合成酶复合体的关键组成部分，负责利用线粒体膜上的质子梯度产生ATP（Neupane等人，2019）。V-ATP酶是一种液泡质子泵，通过ATP水解产生质子梯度，在细胞内pH调节和离子运输中起关键作用（Forgac，2007）。Actin-α是一种进化上保守的细胞骨架蛋白，参与细胞结构维持、细胞内运输和肌肉收缩（Svitkina，2018）。最后，ADP/ATP转运酶（也称为腺嘌呤核苷酸转运蛋白（ANT）促进ADP和ATP在线粒体内膜之间的交换，这一过程对细胞能量代谢至关重要（Halestrap和Brenner，2003）。

由于这些基因在细胞稳态和代谢中的基本作用，我们选择它们作为RNAi靶标，以破坏D. citri的生理机能和存活。在这项研究中，我们首先评估了掺入蔗糖基人工饲料中的dsRNA对成虫死亡率和繁殖力的影响，以评估RNAi介导的效果。根据观察到的基因沉默和表型效应，最有效的两个靶标——ATP合成酶β和Actin-α——随后通过直接将dsRNA注入成年D. citri进行了进一步验证，从而比较了两种递送方法的效率。

章节片段

亚洲柑橘木虱群体

2006年，我们在佛罗里达大学西南佛罗里达研究与教育中心（SWFREC）位于伊莫卡利（Immokalee，北纬26.42°，西经81.42°）的实验果园中收集的成年D. citri个体建立了健康的、无CLas的群体。D. citri是佛罗里达州的入侵物种，自20世纪90年代末以来在该地区定居。由于它分布广泛且未受到保护，因此无需特殊许可

D. citri不同发育阶段的四个目标基因表达

使用qRT-PCR检测了D. citri不同发育阶段的选定目标基因的表达谱，包括第一至第三龄期、第四至第五龄期以及成虫的混合样本。D. citri的内参基因α-tubulin和GAPDH2用于qRT-PCR实验中的基因表达标准化。结果显示，从若虫阶段到成虫阶段，ADP/ATP转运酶的转录本增加了约2.17倍（F(2, 11) = 22.45，p = 0.0001）（图1）。显著

讨论

在这项研究中，我们假设dsRNA介导的这些关键代谢和结构基因的沉默会损害D. citri的存活和繁殖。我们的发现通过基因表达和表型分析证实了这一假设。在最初测试的四个基因中，ATP合成酶β和Actin-α显示出最佳的RNAi靶标效果，表现出显著的转录本下调和生物学效应。这两个基因的沉默导致成虫死亡率增加

CRediT作者贡献声明

贾瓦德·A·库雷希（Jawwad A. Qureshi）：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法论、研究、资金获取、概念构思。阿尔贝托·乌尔巴内哈（Alberto Urbaneja）：撰写——审稿与编辑、验证、研究、概念构思。埃斯梅艾尔·萨贝里（Esmaeil Saberi）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据管理、概念构思。梅里特谢尔·佩雷斯-埃多（Meritxell Pérez-Hedo）：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法论、资金管理

未引用的参考文献

Ferrarezi等人，2019；Galetto等人，2011；Güssow和Clackson，1989；Monzo等人，2014。

作者声明他们与本研究无关任何利益冲突。

利益冲突声明

☒ 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢：

作者感谢Qureshi实验室的Monica Triana提供的专业技术支持。我们感谢Omar Ruiz-Rivero（IVIA）在dsRNA合成方面的协助。这项工作部分得到了西班牙科学与创新部（Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades）通过国家研究机构（Agencia Estatal de Investigación）资助的项目PID2020-113234RR-I00和PID2024-158774OB-I00的支持。MP-H获得了西班牙科学与创新部（Ministerio de Ciencia e Innovación）的Ramón y Cajal奖学金（RYC2022-036061-I）。