松材线虫BxGST3与BxGST1谷胱甘肽S‑转移酶基因的克隆及功能分析

摘要：松材线虫病(Pine wilt disease, PWD)由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起，是全球范围内危害松林的重大病害。谷胱甘肽S‑转移酶(Glutathione S‑transferases, GSTs)是一类关键的II相解毒酶，能够催化谷胱甘肽与异生物质结合，保护生物体免受氧化胁迫和外来化合物的损伤。然而，特定GST基因在松材线虫致病过程中的作用尚不清楚。本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)技术克隆了两个GST基因BxGST3和BxGST1的全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测其在接种黑松(Pinus thunbergii)过程中的表达变化。原位杂交(In situ hybridization)用于定位基因在虫体组织中的表达部位，RNA干扰(RNAi)技术则用于沉默目标基因并评估其对线虫生理的影响。结果显示，两个基因在侵染过程中均显著上调，在接种后24小时达到峰值，BxGST3上调5.1倍，BxGST1上调3.1倍。原位杂交表明其表达主要集中在食管腺、生殖腺及肠道中。RNAi介导的基因沉默降低了线虫的取食活性与繁殖能力，并延缓了松树萎蔫症状的出现。研究结果表明，BxGST3和BxGST1通过参与宿主防御化合物的解毒作用，促进松材线虫的致病性。

松材线虫病被称为“松树癌症”，由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起，通过媒介昆虫松墨天牛(Monochamus alternatus)传播，可在短时间内导致大面积松树死亡，对森林生态系统和经济发展造成严重威胁。尽管已有研究表明谷胱甘肽S‑转移酶(GSTs)在多种生物的抗氧化与解毒过程中发挥重要作用，但在松材线虫中，特定GST基因的功能仍不明确。因此，本研究聚焦于BxGST3和BxGST1这两个基因，旨在揭示它们在松材线虫致病机制中的作用。

研究人员首先利用RACE技术获得BxGST3和BxGST1的全长cDNA序列，并通过生物信息学分析预测其理化性质。随后，采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测接种黑松后不同时间点的基因表达变化，结合原位杂交确定基因的组织分布特征。RNA干扰(RNAi)被用于敲低目标基因，观察其对线虫取食、繁殖及致病力的影响。样本来源于实验室保存的松材线虫AmA3株系，以及温室栽培的两年生黑松幼苗。

全长cDNA扩增与序列分析

通过RACE扩增获得了BxGST3(738 bp，编码207个氨基酸)和BxGST1(702 bp，编码206个氨基酸)的全长序列。蛋白预测显示，BxGST3的理论等电点(pI)为6.91，分子量为23.56 kDa；BxGST1的pI为7.04，分子量为23.87 kDa。

氨基酸序列比对与进化分析

Blastp比对发现，BxGST3与线虫属Caenorhabditis多个物种的GST‑3蛋白相似度为50%–60%，BxGST1与这些物种的GST‑1相似度为40%–50%。系统发育树显示，二者均聚类于线虫分支，其中BxGST1与Caenorhabditis物种的GST‑3聚为一支，支持率高达99%–100%，表明它们在进化上具有高度保守性。

接种后基因表达变化

qPCR结果显示，接种黑松后6至36小时内，两基因的表达持续上升，均在24小时达到峰值，BxGST3上调约5.06倍，BxGST1上调约3.14倍，随后逐渐下降。

原位杂交定位

原位杂交结果显示，BxGST3与BxGST1主要在食管腺和生殖腺中表达，其次在肠道中检测到信号，与已知的线虫解毒基因分布模式一致。

RNAi效率与表型分析

RNAi处理显著降低目标基因的表达水平（BxGST3降低90%，BxGST1降低92%），但不影响线虫形态与存活率。敲低基因后，线虫在真菌培养基上的取食区直径明显缩小，繁殖倍数分别降至124倍（BxGST3）和156倍（BxGST1），远低于对照组（约687倍）。

RNAi后的致病性分析

接种经RNAi处理的线虫至黑松幼苗后，对照组在接种后28天全株枯死，而基因沉默组的症状发展显著延迟，分别在42天（BxGST1）和45天（BxGST3）才完全枯萎。

讨论与结论

本研究首次揭示了BxGST3和BxGST1在松材线虫取食、繁殖及致病过程中的关键作用。研究人员认为，这两个基因通过解毒宿主产生的防御化合物，保护线虫的食管腺和生殖腺免受损伤，从而维持其致病能力。这一发现不仅丰富了松材线虫致病机制的认知，也为未来的防控策略提供了潜在靶点。研究结果发表于《Frontiers in Plant Science》。