靶向细胞衰老的预防性策略：预防脊柱退变与疼痛的 senolytic 疗法

细胞衰老驱动炎症与组织分解，是衰老的关键标志。衰老细胞（Senescent Cells, SnCs）的累积与脊柱组织退变及背痛密切相关。本研究证实，senolytic 药物邻香草醛（o-vanillin）与 RG-7112 的给药可预防 sparc^−/− 小鼠疼痛相关行为的发生。经处理的小鼠椎间盘（Intervertebral Disc, IVD）、椎体终板、椎骨及脊髓中衰老标志物表达降低，同时这些组织中的促炎性衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）因子也受到抑制。早期衰老干预还保留了椎间盘容积与椎骨微结构，表明对结构性脊柱退变具有保护作用。这些发现表明，早期靶向细胞衰老可减轻退行性改变与疼痛，支持 senolytic 疗法作为肌肉骨骼衰退预防性策略的潜力。

**研究背景与问题提出**

细胞衰老是衰老与退行性组织中的关键病理特征，表现为应对 DNA 损伤、氧化应激、线粒体功能障碍及表观遗传不稳定性等应激因素后，细胞周期进入稳定且通常不可逆的停滞状态。衰老细胞在组织中随时间累积，主动参与骨关节炎、神经退行性疾病及癌症等年龄相关病理过程。除丧失增殖能力外，衰老细胞还发展出促炎性衰老相关分泌表型（SASP），由细胞因子、趋化因子、生长因子及基质降解酶等组成，通过破坏结构完整性并放大炎症来改变周围组织微环境，同时促进旁分泌衰老，加剧组织功能障碍。目前识别衰老细胞主要依赖衰老相关 β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）溶酶体活性，但此标志物缺乏特异性。更为明确的指标包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p21 和 p16^Ink4a，分别被广泛接受为早期和晚期衰老的关键分子标志物。p21 主要由 p53 诱导，反映急性应激后的短暂或早期衰老；而 p16^Ink4a 随年龄增长而积累，标志更稳定、更晚期的衰老表型。这些亚型在 SASP 组成和凋亡阈值上亦存在差异，高表达 p16^Ink4a 的细胞对清除更具抵抗力，理解这种异质性对设计衰老清除策略至关重要。

背痛常与椎间盘（IVD）退变相关，是全球伤残生存年的首要原因，仅美国年医疗成本就超过 1000 亿美元。退变椎间盘显示衰老细胞水平升高，表达 IL-1β、IL-6 及基质金属蛋白酶等 SASP 组分，导致细胞外基质分解、神经血管浸润及伤害感受器敏化，最终驱动结构破坏和慢性疼痛。此前研究表明，o-vanillin 或 RG-7112 处理可减少人椎间盘细胞和组织中的衰老细胞及 SASP 因子，改善基质稳态和细胞活力。研究人员还在中年 sparc^−/− 小鼠中证明，这两种药物可减少衰老细胞负荷、改善椎间盘结构、抑制炎症介质并减弱背痛行为表现，但未能使指标恢复至健康动物水平。在此基础上，本研究旨在探究若在背痛出现初期即开始给药，o-vanillin 和 RG-7112 能否预防 sparc^−/− 小鼠的椎间盘退变及相关疼痛；鉴于两种药物分子靶点的差异性，还评估了联合治疗是否较单一治疗具有增效优势。该研究发表于《Advanced Science》。

**关键技术方法**

研究采用 sparc^−/− 小鼠作为早期发生椎间盘退变、背痛及脊柱衰老细胞累积的遗传模型，从 4 月龄（背痛开始出现时）开始每周口服灌胃给药，持续 5 个月至 9 月龄。 Pain behavior was assessed monthly using grip strength assay for axial discomfort, acetone-evoked test for cold sensitivity, and von Frey filaments for mechanical sensitivity. At endpoint, Luminex multiplex assay was used to quantify 15 SASP-associated factors from ex vivo cultured lumbar IVDs. Micro-computed tomography (micro-CT) was employed to evaluate disc volume, bony endplate microarchitecture, and vertebral bone parameters including trabecular and cortical bone. Histological degeneration was graded using FAST staining. Senescence markers were assessed by immunofluorescence for SA-β-Gal, p16^Ink4a, and p21 in IVDs, cartilage endplates, and spinal cord, with colocalization analysis for glial fibrillary acidic protein (GFAP), ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1), and neuronal nuclei (NeuN) in the dorsal horn. Western blot analysis examined molecular targets in IVD tissue. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and osteocalcin immunohistochemistry evaluated bone remodeling, with p16^Ink4a and p21 immunohistochemistry for senescence in vertebral bone.

**研究结果**

**衰老治疗药物预防 sparc^−/− 小鼠疼痛表型的发生**

sparc^−/− 小鼠从 4 月龄开始出现背痛迹象，7 月龄时疼痛已充分建立。通过握力测定评估轴向疼痛，von Frey 和丙酮诱发行为评估放射痛。载体处理的 sparc^−/− 小鼠在所有测试中呈现进行性加重的疼痛表型，而野生型（wt）小鼠保持稳定非疼痛行为特征。基线时 wt 与 sparc^−/−小鼠冷敏感性无显著差异。o-vanillin 或 RG-7112 治疗减弱了冷过敏的发生，o-vanillin 治疗 2 个月、RG-7112 治疗 1 个月后即显现显著效果，4-5 个月后冷敏感性与 wt 动物无显著差异，联合治疗未进一步改善。握力方面，基线时 wt 与 sparc^−/− 小鼠存在微小但显著的差异，o-vanillin 治疗 2 个月、RG-7112 治疗 2 个月后握力下降被阻止，5 个月后联合治疗较单一治疗显著改善握力但仍低于 wt 水平。机械敏感性方面，基线亦存在组间差异，单一治疗 3 个月、联合治疗 2 个月后机械敏感性减弱，4 个月后 o-vanillin、RG-7112 或联合治疗均显著降低机械敏感性且联合治疗达到 wt 同等阈值，5 个月后联合治疗较单一治疗显著改善机械敏感性。各组体重和死亡率无差异，雌雄动物间无显著差异。

**衰老治疗药物减少脊髓中的衰老细胞**

研究人员评估了衰老治疗药物对脊髓背角（伤害性信息中枢处理、整合和调控的主要部位）的影响。载体处理的 sparc^−/− 小鼠背角中 p16^Ink4a 阳性细胞数显著高于 wt 组，与既往报告一致。o-vanillin、RG-7112 或联合治疗均显著减少 p16^Ink4a 阳性细胞，且在所有情况下均达到与 wt 对照相当的水平。为进一步评估衰老治疗药物在调控疼痛表型中的作用并确定哪些细胞群体发生衰老，研究人员将 p16^Ink4a 表达与反应性星形胶质细胞标志物 GFAP、活化小胶质细胞标志物 Iba1 及成熟有丝分裂后神经元标志物 NeuN 进行共定位分析。sparc^−/− 小鼠显示更多的衰老 GFAP 阳性星形胶质细胞、Iba1 阳性小胶质细胞和 NeuN 阳性神经元。o-vanillin 或 RG-7112 衰老治疗显著减少背角中衰老的 GFAP 阳性星形胶质细胞、Iba1 阳性小胶质细胞和 NeuN 阳性神经元，联合治疗未较单一治疗产生额外效应，所有治疗均使水平恢复至 wt 对照所见。总 p16^Ink4a 细胞数超过共定位识别的细胞数，表明其他细胞类型也可能贡献于整体衰老负荷。

**衰老治疗药物减少椎间盘的 SASP 因子释放**

腰椎退变椎间盘表现出 SASP 因子分泌升高。研究人员在实验终点收获处理与未处理动物的腰椎椎间盘，通过 Luminex 多重检测定量 15 种 SASP 相关细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌谱。载体处理的 sparc^−/− 腰椎椎间盘所有 15 种 SASP 因子水平均显著高于 wt 对照。o-vanillin、RG-7112 或联合治疗均显著降低所有 15 种 SASP 因子相对于载体处理 sparc^−/− 小鼠的水平。联合治疗后，CXCL1、CXCL9、CXCL10、CCL2、IL-1β、IL-2、VEGF-α、RANKL 和 M-CSF 等 9 种蛋白水平与 wt 对照无显著差异，表明恢复至 wt 水平。

**衰老治疗药物预防椎间盘容积丢失并减轻衰老细胞负荷和退变严重程度**

研究人员评估了预防性衰老治疗能否保留椎间盘容积和椎间盘健康。sparc^−/− 小鼠腰椎椎间盘容积显著低于 wt 小鼠。单一药物治疗使椎间盘容积轻微保留，但仅 RG-7112 治疗达到统计学显著性。联合治疗改善了结局，更高水平且更显著地保留了椎间盘容积，达到与 wt 小鼠相当的数值。通过验证的组织学评分系统评估椎间盘退变程度，o-vanillin 或 RG-7112 单一治疗均较载体处理 sparc^−/− 显著改善椎间盘退变评分，联合治疗未产生额外效应，o-vanillin 和联合治疗组达到与 wt 对照相当的退变评分。此外，研究人员通过定量 SA-β-Gal、p16^Ink4a 和 p21 阳性纤维环（AF）和髓核（NP）细胞数评估衰老治疗对衰老细胞累积的影响。sparc^−/− 小鼠 AF 和 NP 区域所有三种标志物均显著升高。o-vanillin 或 RG-7112 单一治疗显著减少 AF 和 NP 中 SA-β-Gal、p16^Ink4a 和 p21 阳性细胞，联合治疗产生最显著的降低，接近 wt 对照水平。 RG-7112 在减少 SA-β-Gal 和 p21 阳性细胞方面通常较其他两种治疗效果差，而 o-vanillin 在清除 p16^Ink4a 阳性 NP 细胞方面效果稍差。衰老治疗处理的 sparc^−/− 椎间盘总细胞显著减少，与衰老细胞群体耗竭而非标志物比例转变一致，三种处理间总细胞数无差异。

**衰老治疗药物改变椎间盘中的药物相关分子靶点**

为确定衰老治疗药物是否直接靶向椎间盘内的预期分子靶点，研究人员在治疗终点对椎间盘组织进行蛋白质印迹分析。载体处理的 sparc^−/− 小鼠 NRF-2 表达较低，而 p-p65、p53、MDM2、p16^Ink4a 和 p21 表达较 wt 对照升高。o-vanillin 治疗显著增加 NRF-2 表达并显著降低 p-p65 水平，与 p53 和 MDM2 无显著差异。RG-7112 治疗显著增加 p53 表达，与 NRF-2、p65 和 MDM2 无显著差异。联合治疗较载体处理的 sparc^−/− 小鼠显著增加 NRF-2 和 p53 表达并显著降低 p-p65 水平。与联合治疗相比，RG-7112 治疗导致显著较低的 NRF-2 和显著较高的 p-65、p53 和 MDM2。此外，o-vanillin、RG-7112 或联合治疗均显著降低椎间盘组织中 p16^Ink4a 和 p21 表达。

**衰老治疗药物改善终板健康并减少衰老**

椎间盘退变和衰老已在 sparc^−/− 模型中被广泛研究，而软骨终板和骨终板此前未被仔细考察。终板是调节椎间盘与椎体之间营养和代谢物运输的关键结构。micro-CT 评估显示，载体处理的 sparc^−/− 小鼠腰椎骨终板骨体积/组织体积（BV/TV）显著较高，孔隙率显著较低，这些变化可能限制营养交换并促进椎间盘细胞的不利微环境，从而促进退变和细胞衰老。单一药物治疗使 BV/TV 降低，RG-7112 与载体处理组相比达到统计显著性。联合治疗产生最显著和稳健的 BV/TV 降低，显著低于单一药物治疗，但 BV/TV 值未完全达到 wt 水平。单一药物治疗均显示孔隙率增加，联合治疗增加最大，将结构完整性保留至与 wt 小鼠相当的水平。软骨终板中，SA-β-Gal、p16^Ink4a 和 p21 阳性细胞在 sparc^−/− 小鼠中均显著升高。o-vanillin 和 RG-7112 处理较载体处理显著减少 SA-β-Gal 阳性细胞，单一治疗亦减少 p16^Ink4a 和 p21 阳性细胞数。联合治疗较 sparc^−/− 小鼠也显著降低 SA-β-Gal 和 p16^Ink4a 表达，但与任一单一治疗无显著差异。相比之下，p21 表达在联合治疗后较两种单一治疗均显著降低，并接近 wt 水平。

**衰老治疗药物改善椎骨参数、减少衰老并调控骨重塑**

sparc^−/− 小鼠除椎间盘退变和背痛外，还存在骨质减少。micro-CT 分析显示，与 wt 小鼠相比，sparc^−/− 小鼠 BV/TV、骨小梁厚度（Tb. Th）和骨小梁数量（Tb. N）显著降低，骨小梁分离度（Tb. Sp）显著增加。RG-7112 单一治疗显著改善 Tb. Th。联合治疗导致除 Tb. Sp 外所有参数的显著改善。皮质骨参数分析显示，sparc^−/− 小鼠骨体积（BV）和平均惯性矩（MMI）显著低于 wt 小鼠。单一和联合治疗均显著增加 BV，单一治疗后 MMI 改善，联合治疗未产生叠加效应。皮质厚度（Cs. Th）参数组间无显著差异。TRAP 染色鉴定破骨细胞活性，骨钙素免疫组化反映成骨性骨形成。与 wt 对照相比，载体处理的 sparc^−/− 小鼠椎骨中 TRAP 阳性细胞显著增多，骨钙素阳性细胞显著减少。o-vanillin 治疗较载体处理显著减少 TRAP 阳性细胞并显著增加骨钙素阳性细胞。RG-7112 治疗亦减少 TRAP 阳性细胞，但 TRAP 减少和骨钙素增加未达统计显著性。联合治疗较载体处理显著减少 TRAP 阳性细胞并显著增加骨钙素阳性细胞。椎骨中 p16^Ink4a 和 p21 阳性衰老细胞免疫组化显示，sparc^−/− 小鼠两种标志物均显著高于 wt 小鼠。单一衰老药物处理使两种标志物阳性细胞均大幅减少。联合治疗也较载体处理减少两种标志物，但未较任一单一治疗产生额外效应。

**讨论与结论**

细胞衰老越来越被认识到是肌肉骨骼退变和慢性疼痛的因果驱动因素。在椎间盘中，衰老细胞累积促进细胞外基质分解、炎症信号和椎间盘源性疼痛。衰老清除策略调节 SASP 产生或选择性清除衰老细胞，在年龄相关组织功能障碍中显示出治疗前景。由于椎间盘退变和衰老细胞累积与背痛密切相关，衰老清除疗法为疾病预防提供了令人信服的机遇。

Neuroinflammation is a critical component of chronic pain pathogenesis. sparc^−/− 小鼠背角中观察到的 p16^Ink4a 表达升高与既往报告一致，将脊髓衰老与疼痛状态联系起来。本研究在背角中鉴定出衰老的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元，衰老治疗均使其减少。与外周组织不同，联合治疗在脊髓中未显示叠加效应，提示中枢神经系统驻留衰老细胞可能具有共同的脆弱性。这些发现支持衰老神经和胶质群体在中枢敏化中的作用，并支持其清除作为恢复脊髓稳态和缓解疼痛的潜在策略。

衰老治疗在椎间盘中广泛抑制了 SASP 活性。与既往中期干预仅减弱 10 种因子相比，早期治疗使所有 15 种测量的 SASP 因子均降低，其中联合治疗后 9 种蛋白水平恢复至 wt 水平，表明早期治疗在促炎反馈稳定前进行拦截可实现更全面的炎症抑制。CXCL1、CXCL10 等趋化因子以及 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 等关键细胞因子的降低，VEGF-α 和 RANKL 的下调，表明早期衰老治疗限制了血管生成和破骨细胞生成级联。

组织学分析确认了椎间盘中 SA-β-Gal、p16^Ink4a 和 p21 阳性细胞的减少。值得注意的是，清除 p21 阳性软骨终板细胞需要联合治疗，表明不同衰老亚群之间存在差异性脆弱性，p21 驱动的衰老可抵抗单一药物治疗。p21 阳性软骨终板细胞的清除需要联合治疗，这一发现支持联合衰老清除策略的必要性。

sparc^−/− 小鼠终板钙化较 wt 动物更多、孔隙率更低，与人类椎间盘退变模式一致。o-vanillin 和 RG-7112 治疗降低了终板骨体积并增加孔隙率，表明衰老干预可能部分逆转退变性终板改变并改善支持溶质运输的结构条件。靶向骨终板中的衰老细胞可能有助于恢复这一营养通路并支持椎间盘健康。

sparc^−/− 小鼠显示的骨质减少被认为促进背痛的发生和发展。治疗动物显示椎骨小梁和皮质结构保留，衰老的骨细胞和破骨细胞减少，与既往骨骼衰老中的衰老清除研究一致。重要的是，椎骨骨重塑在受托动物中发生改变，破骨细胞相关活性降低，成骨细胞活性增强，表明 o-vanillin 和 RG-7112 有助于将椎骨骨转换重新平衡至较少分解代谢的状态。

从机制上看，o-vanillin 和 RG-7112 靶向不同的存活通路。RG-7112 诱导 p53/p21 驱动衰老细胞的凋亡，而 o-vanillin 调节 NF-κB 和 p16^Ink4a 驱动群体。IL-6 的叠加抑制和 p21 阳性细胞清除的增强支持互补活性。重要的是，治疗时机强烈影响结局：中期干预需要两种药物全剂量且仅联合治疗实现全面效应，而早期干预允许单一治疗有效抑制，表明新生衰老细胞具有更大的脆弱性。

**研究结论**：sparc^−/− 小鼠模型在多个与背痛相关的肌肉骨骼组织中表现出改变。研究数据证实，o-vanillin 和 RG-7112 口服衰老治疗可能反映跨脊柱组织的联合作用，其预防衰老细胞累积、抑制 SASP 产生、保留椎间盘和骨骼完整性，并预防 sparc^−/− 小鼠的慢性疼痛行为。这些发现将细胞衰老确定为脊柱退变和疼痛的机制性驱动因素，并证明早期干预为多个脊柱区域提供持久保护。研究结果支持将衰老治疗策略转化用于有早期发生或遗传驱动的椎间盘退变风险个体的预防性临床应用。