一种三元季铵盐配方的快速杀菌和杀线虫作用机制:通过破坏细菌细胞膜以及损伤木蠹虫(Bursaphelenchus xylophilus)的表皮来实现

时间:2026年5月26日
来源:Pesticide Biochemistry and Physiology

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李梦瑶|窦月文|郑永超|孔玲策|崔燕|陈立坤|吴斌|郭凯|赵崇林|韩少杰中国浙江省杭州市浙江大学生物技术研究所,水稻生物学与育种国家重点实验室,作物病原菌与昆虫生物学重点实验室,邮编310058摘要松树萎蔫病由Bursaphelenchus xylophilus及其相关细菌群落引

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李梦瑶|窦月文|郑永超|孔玲策|崔燕|陈立坤|吴斌|郭凯|赵崇林|韩少杰
中国浙江省杭州市浙江大学生物技术研究所,水稻生物学与育种国家重点实验室,作物病原菌与昆虫生物学重点实验室,邮编310058

摘要

松树萎蔫病由Bursaphelenchus xylophilus及其相关细菌群落引起,对全球林业构成了严重的生物安全威胁。受感染木材的植物检疫管理需要具有快速、广谱杀菌活性和直接杀线虫效果的物质。我们研究了AQAS这种多组分消毒剂的抗菌和杀线虫特性,该消毒剂由短链、长链和双链季铵化合物(QACs)与乙醇及双重螯合缓冲系统组成。在1:19的工作稀释度下,AQAS对大肠杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌的杀灭效果在1.0分钟内超过了5.0 log。时间杀灭动力学显示,在5% AQAS浓度下,金黄色葡萄球菌在30秒内被完全灭活,铜绿假单胞菌在3分钟内被完全消除。荧光探针检测(DiSC3(5), NPN, PI)显示细胞膜在15秒内发生去极化,细胞包膜屏障功能逐渐丧失,扫描电子显微镜观察发现革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞均出现严重结构破坏。对于B. xylophilus,AQAS表现出剂量依赖性的致死性,LC50为33.32 ppm,伴随僵直麻痹和明显的角质层塌陷。成分级别的生物测定证实,每种单独的QAC成分、所有成对的二元组合以及三元组合均具有独立的杀线虫活性(LC50范围为32.23–61.70 ppm),但其作用模式不符合典型的协同效应。在实验室木材浸泡试验中,5% AQAS使可恢复的活线虫数量减少了97.9%,并在存活的线虫中产生了86.2%的死亡率。这些发现支持AQAS作为快速植物检疫消毒剂的潜力,但仍需在实际木材处理条件下进行现场验证。

引言

松树萎蔫病(PWD)由松树线虫(PWN)Bursaphelenchus xylophilus引起,是全球林业生态系统面临的最具破坏性的生物威胁之一(Bo等人,2008年;Vicente等人,2012年;Zhao,2008年)。自该病原体在北美首次被发现以来,它已迅速蔓延至东亚和欧洲部分地区,导致灾难性的生态破坏和每年数十亿美元的经济损失(Tarek等人,2012年)。这种线虫侵入易感松树的树脂导管系统,引发一系列生理故障,包括树脂分泌停止、木质部导管空洞化以及系统性萎蔫,通常导致树木在一个生长季节内死亡(Fukuda,1997年;Futai,2013年)。死亡和垂死的树木成为线虫的重要储存库,随后通过昆虫媒介(主要是Monochamus属的长角甲虫)传播给健康宿主(Akbulut,2012年;Takasu,2009年)。因此,及时清除受感染的木材并进行植物检疫处理(包括感染木材、树桩和加工残余物)是切断传播途径和控制PWD扩散的关键策略(Sheng等人,2025年;Tang等人,2023年;Ma等人,2024年)。
然而,有效管理PWD感染的基质仍然是一个巨大的挑战。目前的植物检疫方法主要依赖于热处理(热灭菌)、焚烧或化学熏蒸(Kang等人,2025年;Guo等人,2025年)。虽然这些方法有效,但在偏远林业地区往往能耗高且操作受限(Back等人,2024年;Robinet等人,2024年)。化学熏蒸,特别是使用溴甲烷,曾是行业标准,但由于其对臭氧层的严重破坏性和神经毒性,正在全球范围内逐步淘汰(Back等人,2024年)。替代熏蒸剂如氟磺酰氟或磷化氢通常需要较长的暴露时间或高剂量,限制了其在紧急情况下的快速响应效率(Back等人,2024年)。此外,最近的病理学研究表明,PWD不仅仅是线虫引起的,而是涉及相关细菌的复杂病原体相互作用(Song等人,2025年;Sheng等人,2025年)。B. xylophilus携带的细菌群落,如金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌Pantoea属细菌,能够促进线虫繁殖、分泌加速宿主萎蔫的植物毒素或降解宿主防御化合物(Wang等人,2024年;Hao等人,2023年)。因此,理想的PWD控制消毒剂必须具备双重作用:快速消灭主要真核病原体B. xylophilus,同时抑制促进毒力和持续性的原核微生物(Mannaa等人,2024年;Zou等人,2025年)。
季铵化合物(QACs)是一类阳离子表面活性剂,在临床和工业消毒中广泛应用,因为它们具有广谱抗菌活性、化学稳定性以及相对于醛类或氧化剂的较低毒性(Lennartz等人,2025年)。这种膜破坏导致细胞内成分泄漏,最终导致细胞死亡(Abdollahi等人,2024年;Zhou等人,2024年)。尽管QACs在消毒中占据主导地位,尤其是在COVID-19大流行期间使用量激增(Wang等人,2025年;Lazofsky等人,2022年),但它们也存在一些局限性。传统的单链QACs如苯扎氯铵(BAC)对复杂微生物结构的杀菌效果较差,并可能受到有机物的干扰(Liao等人,2025年;Hedges等人,2025年)。更令人担忧的是,过度使用和滥用QACs可能导致抗菌素耐药性(AMR),细菌会发展出如外排泵等机制来对抗其作用(Lv等人,2025年;Su等人,2024年)。这种耐药性的发展尤其成问题,因为QACs可能同时选择性地促进对临床重要抗生素的耐药性(Wang等人,2025年;Liu等人,2023年)。最近的研究集中在开发下一代QAC配方以克服这些限制,包括具有双重阳离子中心的双季铵化合物(GQAs)(He等人,2025年;Zhou等人,2024年)、大环季铵盐(MQAs)(Kopiasz等人,2024年)以及将QACs与抗菌肽(He等人,2025年)或其他生物活性基团结合的混合结构(Li等人,2025年;Gao等人,2024年)。这些创新旨在提高抗菌活性,同时降低耐药性风险并保持生物相容性(Li等人,2025年)。然而,QACs的环境持久性和生态影响仍然是需要进一步研究的重大问题(Lennartz等人,2025年;Flanjak等人,2024年)。
为了解决这些限制,基于成分互补的配方工程提供了一种改进快速消毒性能的实际途径。先前的研究表明,将不同链结构的季铵化合物与醇类和螯合剂结合使用,可以增强膜相互作用,加速包膜不稳定,并提高对水质变化的耐受性。在此背景下,我们制备了一种复合QAC消毒剂AQAS,包含三种QAC活性成分以及乙醇和螯合缓冲系统,并评估了这种多组分配方是否能够实现快速的杀菌和杀线虫效果。
鉴于脂质屏障在细菌包膜和线虫角质层中的结构重要性,我们进一步探讨了AQAS是否可以作为针对B. xylophilus的快速作用剂。本研究的目标是:(1)量化AQAS的杀线虫活性并确定其对B. xylophilus的LC50;(2)使用荧光检测和扫描电子显微镜评估膜和角质层的损伤;(3)在实验室木材浸泡试验中验证AQAS是否能够减少受感染松木中的可恢复线虫数量。

章节摘录

材料与试剂

本研究制备了复合季铵消毒剂AQAS。在标准配方中,活性成分包括三种QAC混合物:1.5%(重量/重量)十二烷基二甲基苄基铵氯化物(短链,用于快速渗透,C12-BAC)、1.5%(重量/重量)十四烷基二甲基苄基铵氯化物(长链,用于膜破坏,C14-BAC)和1.5%(重量/重量)二烷基二甲基铵氯化物(双链,用于增强稳定性和抗病毒活性,DDAC)。乙醇(3.0%,重量/重量)

AQAS的广谱抗菌活性

AQAS是一种多组分消毒剂配方,包含三种QAC活性成分以及乙醇和螯合缓冲系统。标准配方呈弱碱性(pH约8.95),随后对其对代表性测试微生物的快速活性进行了评估。
首先在20°C和1.0分钟接触时间内,通过定量悬浮试验评估了AQAS的广谱抗菌性能。

讨论

本研究表明,AQAS这种复合多组分消毒剂对细菌测试微生物和松树线虫B. xylophilus均具有快速作用。在细菌中,该配方在几秒到几分钟内即可致死;在线虫中,它产生了低的水溶性LC50和SEM可见的严重角质层损伤。这些发现支持AQAS作为进一步在卫生和林业生物安全领域评估的有希望的候选物质。
细菌作用机制

机构审查委员会声明

不适用。

知情同意声明

不适用。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金区域创新与发展联合基金(U25A20631)的关键支持项目、国家自然科学基金及其他作者列出的支持来源的资助。

CRediT作者贡献声明

李梦瑶:研究、数据管理。窦月文:研究、数据管理。郑永超:资金获取、概念构思。孔玲策:数据分析、数据管理。崔燕:研究、数据分析。陈立坤:研究、数据分析。吴斌:监督、研究。郭凯:撰写——审稿与编辑、监督。赵崇林:撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督。韩少杰:撰写——初稿撰写、监督。

利益冲突声明

作者声明已提交基于本手稿部分发现的专利申请。作者没有其他需要声明的利益冲突。

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