生长偶联型血红素生物传感器赋能谷氨酸棒杆菌中血红素生物合成酶的定向进化

血红素是一种必需辅因子，参与多种细胞过程，也是微生物生物合成的重要靶标。然而，由于需要多种通路酶的协同活性，并且缺乏可扩展的酶水平筛选策略，微生物血红素生产的工程化仍然面临挑战。在本研究中，研究人员在谷氨酸棒杆菌中建立了一个生长偶联筛选系统，方法是构建一种基于ChrSA的血红素生物传感器，该传感器来源于天然血红素响应型双组分系统，可将胞内血红素水平直接转换为可选择的生长表型。利用这一由生物传感器赋能的系统，研究人员针对粪卟啉依赖型（coproporphyrin-dependent，CPD）血红素生物合成途径中的4种关键酶构建了随机诱变文库，并通过生物传感器引导的选择鉴定出改良变体。随后，研究人员通过染色体等位基因替换对所筛选变体进行了验证，在天然、单拷贝调控条件下使血红素产量总体提高约38.9%，终产量达到308.7 mg/L。序列与结构分析表明，有益替换位点主要分布于催化残基之外，提示酶稳定性及构象性质的改变促进了血红素生物合成增强。本研究建立了一种用于紧密偶联代谢通路中酶变体筛选的血红素生物传感器引导策略，并为微生物血红素通路工程提供了一种实用的系统层面方法。

本文发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》，聚焦于谷氨酸棒杆菌中血红素生物合成通路的酶工程优化问题。血红素作为铁-卟啉辅因子，广泛参与信号转导、氧运输和电子传递等生命过程，同时在医药、食品和精细化学品制造中具有重要应用价值，因此提升微生物细胞工厂的血红素合成能力具有明确的基础研究和产业化意义。现有研究表明，血红素生物合成属于高度保守但调控复杂的多步代谢网络，其优化难点不仅在于前体供给、酶促反应衔接和副产物毒性控制，还在于缺乏适用于大规模筛选的通路输出表型工具。尤其对于谷氨酸棒杆菌中的粪卟啉依赖型（coproporphyrin-dependent，CPD）途径，尽管相较于原卟啉依赖型（protoporphyrin-dependent，PPD）途径具有更优的产量表现和热力学驱动力，但其性能仍受到氧化胁迫、铁依赖调控和多酶紧密耦合等多重限制，导致单纯依靠理性设计难以有效定位真正提升通路通量的关键酶变体。因此，开发一种能够把胞内血红素水平直接转化为可筛选表型的系统，是推进血红素通路工程的关键问题。

围绕这一问题，研究人员构建了一个基于谷氨酸棒杆菌天然ChrSA双组分系统（two-component system，双组分信号转导模块）的血红素响应型生长偶联生物传感器。该系统利用ChrS感知血红素并激活ChrA，继而驱动启动子PhrtBA介导四环素抗性基因tcR表达，使胞内血红素积累水平与细胞在四环素压力下的存活能力直接耦联。与依赖荧光或转录输出的传统转录因子型传感器不同，这一设计将代谢物感知转化为直接可选择的生长优势，更适合用于平板上的大规模筛选。进一步地，研究人员以该平台为基础，对CPD途径中的4个关键酶编码基因hemE、hemY、hemH和hemQ实施随机诱变和定向进化筛选，并将得到的优良变体回补至染色体原位进行验证，从而在不依赖高拷贝表达和额外强启动子放大的前提下，评估这些变体在天然调控背景下对血红素生物合成的真实贡献。研究结果表明，该策略能够有效识别促进通路输出的酶变体，最终获得的组合菌株在单拷贝、内源调控条件下血红素产量提高38.9%，达到308.7 mg/L。更重要的是，结构分析提示提升效应主要并非来源于催化位点改造，而与酶稳定性、局部相互作用和构象动力学调节相关，这一发现扩展了对CPD途径酶工程可改造空间的认识。

本研究所采用的关键技术方法主要包括：首先，在谷氨酸棒杆菌中构建以ChrSA双组分系统为核心、以四环素抗性为输出的血红素响应型生长偶联生物传感器，并通过核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）组合设计和启动子替换优化其响应范围；其次，对hemE、hemY、hemH和hemQ分别建立随机诱变文库，并在四环素平板上进行生长偶联高通量筛选；再次，通过染色体等位基因替换逐步将优选突变导入宿主基因组，并利用摇瓶发酵、荧光法和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）定量检测血红素；最后，结合AlphaFold3结构预测、分子对接和分子动力学模拟分析有益突变的潜在结构基础。

在研究结果方面，论文依次从生物传感器构建、性能优化、酶变体筛选与验证以及结构机制分析几个层面展开。

3.1. Development and functional characterization of a ChrSA-based heme-responsive biosensor
研究人员首先开发并功能表征了基于ChrSA的血红素响应型生物传感器。考虑到卟啉类物质具有较强光吸收特性，会干扰荧光读出，因此研究中没有采用传统荧光筛选，而是设计了以四环素依赖生长为输出的选择系统：当胞内血红素不足时，ChrS不被激活，ChrA不能有效启动PhrtBA，tcR不表达，细胞在四环素平板上不能生长；当胞内血红素积累时，信号经ChrSA系统传递并激活tcR表达，细胞因获得四环素外排能力而能够存活。结果显示，该系统具有明确的血红素依赖性生长响应。在10 μg/mL四环素条件下，无外源血红素时菌株不生长，而低于该抗生素浓度时仍存在残余生长，因此10 μg/mL被确定为筛选阈值。在这一条件下，低于10 μM的血红素浓度不能形成菌落，10–20 μM范围内菌落数明显上升，说明该传感器能够区分不同血红素水平。随着血红素进一步升高，菌落形成反而下降，提示在达到激活阈值后，额外血红素不再继续增强抗性表达，同时高浓度血红素可能抑制细胞生长。该部分结果证明ChrSA模块可被改造成将胞内血红素直接映射为可选择表型的工具。

3.2. Optimization of the heme biosensor response range by RBS and promoter engineering
在证明ChrSA系统可行后，研究人员进一步通过RBS和启动子工程调节ChrS与ChrA的表达水平，以拓宽传感器的工作范围。首先，在Ptuf启动子控制下，分别为chrS和chrA配置高（H）、中（M）、低（L）三种翻译强度的RBS，构建9种组合。结果显示，不同表达组合显著改变了血红素依赖生长曲线。其中C2（H-H）和C3（H-M）在20–60 μM血红素范围内表现出连续、剂量依赖性的菌落增加，且未出现明显饱和；而其他组合多呈钟形响应，或者在低浓度即达到峰值并在高浓度下受抑。由此筛选出HChrS-HChrA和HChrS-MChrA作为较优组合。随后，研究人员又将Ptuf替换为P69或Ptrc，对上述优选RBS组合进行进一步测试。P69驱动时，系统在无血红素条件下已有较强背景激活，失去了良好的依赖性控制；Ptrc驱动时，激活阈值则被推高到40–60 μM，造成灵敏度过低。综合比较后，Ptuf-H-H构型被确定为最终筛选用生物传感器。定量剂量-反应分析进一步显示，优化后传感器的动态范围由6.59倍提升至12.27倍，EC₅₀由13.36 μM提高至38.28 μM，Hill系数由5.635降至3.887，表明其在较高血红素浓度下具有更好的分辨能力和更平缓的响应过渡，更适合筛选高产菌株。这一部分说明，通过信号模块表达调节，天然ChrSA系统不仅保留了血红素感知能力，而且可被改造为适用于高血红素条件下的生长偶联筛选平台。

3.3. Identification of functionally improved heme biosynthetic enzyme variants using the ChrSA-based growth-coupled heme biosensor
在获得优化传感器后，研究人员将其用于CPD途径关键酶的定向进化筛选。研究逻辑在于：CPD途径多步反应彼此紧密耦联，单一酶的改造未必直接提升总体通量，因此必须在通路输出层面对酶变体进行筛选。研究中分别对hemE、hemY、hemH和hemQ构建独立随机诱变文库，并将其导入宿主菌株形成对应的筛选库。随后，在含30 μg/mL四环素的平板上进行生长偶联选择，按照菌落出现情况和生长表现从每个文库中挑取96个形态正常且分离良好的菌落，进入摇瓶初筛。经两轮筛选后，分别获得表现最佳的E96、Y96、H96和Q96变体，其血红素产量相对于亲本分别提升47.4%、38.6%、45.4%和56.9%。为了确认这些改造在天然表达背景下是否仍然有效，研究人员进一步通过染色体等位基因替换，将优选突变逐步整合到谷氨酸棒杆菌基因组中，构建L1至L4系列菌株。L1携带hemE_{L42F/S144P/V229A}，L2在此基础上进一步引入hemY_I28V，L3继续加入hemH_{H23L/R89G/D169G/E181V/S272T}，L4则再加入hemQ_K51E/K115R。结果显示，随着优选等位基因逐步累积，血红素产量持续上升。与参考菌株L0相比，L4血红素产量提高38.9%，荧光法测得终产量为308.7 mg/L；HPLC复核结果亦证实提升趋势一致。这一结果说明，基于生物传感器的筛选不仅能在质粒层面富集高效变体，而且这些变体在单拷贝、内源调控状态下仍具有实际增产效果。论文同时指出，染色体整合后的提升幅度低于质粒筛选阶段，这与拷贝数下降和保留天然调控架构有关，但这种策略具有更好的遗传稳定性，因此更具应用实用性。

3.4. Computer simulations reveal potential effects of the beneficial mutants
在获得功能提升变体后，研究人员通过结构预测、分子对接和分子动力学模拟分析这些突变的潜在作用机制。整体结果显示，HemE、HemY、HemH和HemQ中的有益突变均未直接位于催化残基上，这提示通路性能提高并非来自催化中心直接重塑，而更可能来自对蛋白局部环境、构象柔性及稳定性的间接调控。具体而言，HemE_{L42F/S144P/V229A}中的L42F位于底物结合口袋附近，可能通过增强疏水相互作用影响局部微环境；S144P引入脯氨酸后可能限制主链柔性、提高局部刚性；V229A则通过减小侧链体积缓解空间位阻、改变局部堆积方式。HemY_I28V位于蛋白结构界面区域，可能增强局部疏水作用并改善亚基装配稳定性。HemH_{H23L/R89G/D169G/E181V/S272T}中的多处表面突变将较大极性残基替换为较小非极性残基，可能通过降低位阻和增强疏水堆积稳定局部构象；其中R89G虽破坏与D130的氢键，但可能扩大靠近底物口袋的局部空间；E181V虽消除了与K261的氢键，却可能改变周边二级结构间相互作用；S272T则可能通过弱氢键和口袋填充效应稳定底物相关微环境。HemQ_K51E/K115R中，K51E位于蛋白表面暴露区域，电荷反转可能引发局部α螺旋轻微位移并通过远程构象效应影响催化；K115R邻近底物结合口袋，可能增强局部氢键作用并稳定口袋结构。综合来看，这些非催化位点突变可能通过改变局部相互作用网络、构象行为和结构动力学来提升酶功能及通路整体输出。论文特别指出，这些有益替换在既往CPD途径工程研究中尚未见报道，因此为后续理性设计和组合优化提供了新的序列层面靶点。

讨论部分表明，本研究的核心贡献在于把天然ChrSA血红素响应系统重构为一种可扩展的生长偶联筛选平台，并将其成功应用于紧密偶联代谢通路的酶变体发现。研究结果说明，对多酶协同控制显著的CPD途径而言，仅凭单酶过表达往往难以取得稳定增产，而以通路终产物为核心输出的生物传感器筛选，能够在更接近系统真实约束的条件下识别有效突变。另一方面，所发现的有益突变主要位于非催化位点，提示代谢工程中常被忽视的蛋白稳定性、构象柔性和微环境重塑，在提升复杂通路通量方面可能具有重要作用。该研究因此不仅提供了一套血红素途径工程的方法学框架，也为今后开展更高层级的路径平衡、前体供给增强和毒性缓解提供了可结合的基础。

研究结论部分可翻译为：本研究基于谷氨酸棒杆菌天然ChrSA血红素响应系统开发了一种生长偶联筛选策略。该策略能够将胞内血红素积累转化为可选择的生长表型，从而实现对CPD途径酶变体的选择型筛选。利用该方法，研究人员鉴定并验证了多个改良的CPD途径酶变体；经染色体等位基因替换后证实，这些变体在天然单拷贝调控条件下仍保留了改进的通路性能。值得注意的是，本研究还揭示了CPD途径酶中此前未受到充分重视的功能有益非催化突变，提示酶稳定性与构象调节可能促进血红素生物合成。此外，通过将胞内血红素水平与四环素依赖生长耦联，并调节ChrS和ChrA的表达水平，本研究进一步提升了ChrSA模块在高血红素条件下用于生长偶联通路筛选的适用性。总体而言，这些发现拓展了基于ChrSA的血红素感知系统的应用范围，并为挖掘和验证促进微生物血红素生产的酶变体提供了实用的系统层面框架。