肥胖诱发的认知功能下降与脑自噬（autophagy）改变相关。然而，关于高脂饮食（high-fat diet, HFD）对脑影响的研究仍缺乏证据，且结果存在争议。间歇性断食（intermittent fasting, IF）可能提高神经退行性疾病中海马神经发生水平，但其涉及的分子机制尚不明确。本研究旨在评估IF对肥胖大鼠模型中破坏脑自噬相关认知障碍的神经保护作用。研究人员将24只雄性大鼠分为对照组、断食瘦体组、肥胖组（HFD喂养）及肥胖断食组；通过行为学测试、生化检测及分子分析（炎症标志物、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）及自噬相关基因）来评估认知功能及其潜在机制。研究结果表明，IF干预显著减轻HFD诱导的认知损伤和神经炎症，提高BDNF水平，改善组织学改变，降低Beclin-1和p62的免疫组织化学表达，并上调LC3和ATG5的mRNA表达。IF可预防HFD诱导的认知障碍，其机制可能由大脑皮层和海马自噬功能障碍介导，强调自噬通路对正常神经元功能的重要性。这些结果提示，IF通过调控大鼠自噬功能，保护神经系统免受HFD诱导的炎症和氧化应激，对神经元存活至关重要。
## 研究背景与问题提出
近年来，全球膳食脂肪摄入量显著增加，自1980年以来肥胖患病率已翻倍。肥胖及其相关疾病（包括心血管疾病、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、精神障碍、高脂血症和高血压）的有害影响已得到广泛证实。流行病学研究表明，长期摄入大量饱和脂肪显著增加痴呆和认知障碍风险，但HFD影响认知的具体机制尚不充分明确。多种病理生理机制参与肥胖相关认知损伤，包括脑血管完整性下降、血脑屏障破坏，继而激活神经炎症和神经退行性变。动物模型研究显示，长期HFD导致血浆IgG渗漏至海马血管周围区域，海马微血管密度降低，损害海马依赖性认知功能。
自噬（autophagy）是维持细胞稳态所必需的细胞存活过程，能够回收旧细胞成分并清除受损细胞器和蛋白聚集体。自噬在清除神经元tau蛋白和β-淀粉样蛋白（amyloid β, Aβ）聚集体中发挥重要作用，而这些物质的积累与自噬反应缺陷相关，加剧多种神经退行性疾病中的认知功能障碍。因此，自噬激活在脑损伤和神经退行性疾病中具有关键神经保护作用。然而，关于HFD对脑自噬影响的研究仍缺乏证据，文献报道结果存在争议。肥胖人体和动物模型中检测到自噬改变，但评估困难且结果有时相互矛盾。
IF是指交替进行正常进食与长时间少量或不进食的饮食模式，已显示出对抗肥胖及其合并症的益处，同时具有维持血糖正常范围、降低胰岛素和炎症等多种健康效益。前期研究表明IF可能提高神经退行性疾病和急性脑损伤（如卒中）模型中海马神经发生水平。作为药物治疗以外的策略，像饮食和运动等生活方式干预已被提议用于管理和预防以认知障碍为特征的疾病。此外，新兴证据还表明IF可通过诱导自噬调节来发挥作用。然而，IF诱导神经发生和脑自噬调控的分子过程知之甚少。
尽管先前研究独立探讨了HFD暴露的认知、炎症或自噬后果，但缺乏将这些因素整合评估的研究。据研究人员所知，尚无研究同时考察神经炎症、自噬失调和神经可塑性在HFD诱导认知下降中的相互作用，特别是在IF干预背景下。因此，本研究旨在通过多水平方法连接行为学、分子和组织学结局，为IF在肥胖大鼠模型中的病理生理机制提供新见解。该研究发表于《Scientific Reports》。
## 主要技术方法
研究采用24只成年（2月龄）雄性Sprague Dawley大鼠，购自埃及Zagazig大学医学院动物房，避免发情期激素变化对脑生理的影响。大鼠随机分为四组（n=6/组）：对照组（标准饲料）、断食瘦体组（FL，标准饲料，每周非连续三日24小时断食）、肥胖组（HFD喂养2个月，饲料含58.3%脂肪、20.2%蛋白质、21.5%碳水化合物，供能5.40 kcal/g，由Zagazig大学农学院制备）、肥胖断食组（FO，同HFD喂养，每周非连续三日24小时断食）。研究结束后进行行为学测试（Crawley社会性测试、强迫游泳测试、改良T迷宫测试），随后处死取材。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清和脑匀浆中白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、BDNF、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色评估脑组织病理学改变；免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测Beclin-1和p62表达；实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）检测Beclin-1、LC3-II和ATG5 mRNA表达。统计学分析采用GraphPad Prism 5软件，正态分布数据采用Tukey事后检验，非正态分布采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。
## 研究结果
### IF对体质量和脑形态的影响
HFD显著增加终末体质量和体重指数（body mass index, BMI）（与对照组比较p < 0.001，p < 0.01；与FL组比较p < 0.001）。FO组终末体质量和BMI较肥胖非断食组降低（p < 0.001），但仍显著高于FL组。FL组终末体质量和BMI显著低于对照组（p < 0.001，p < 0.05）。各组间脑大体形态无显著差异。
### IF对社会动机、社会记忆和新奇性的影响
Crawley社会性测试结果显示，HFD显著损害社会动机，表现为肥胖组在空室中停留时间（135.8 ± 24 s）较对照组（343.3 ± 35.02 s）和FL组（374.5 ± 35.97 s）显著增加（p < 0.001），而与陌生大鼠社交时间减少。FO组显著逆转这些改变：空室时间（206.5 ± 12.63 s vs 267.3 ± 31.10 s）显著降低（p < 0.01），与陌生鼠社交时间（252.2 ± 16.73 s）显著高于肥胖非断食组（p < 0.001）。第三场测试中，HFD显著损害社会新奇性，肥胖组与陌生鼠1停留时间（143.5 ± 19.73 s）较FL组（287.8 ± 29.59 s）和对照组（329.0 ± 16.40 s）显著减少（p < 0.001）；FO组显著改善社会新奇性损伤，与陌生鼠1和2停留时间（226.5 ± 16.27 s和288.3 ± 29.94 s）均显著高于肥胖组（p < 0.01，p < 0.001）。对照组、FL组和FO组中陌生鼠2停留时间显著多于陌生鼠1（分别为p < 0.05，p < 0.001，p < 0.01），而肥胖组无显著差异（p > 0.05）。
### IF对抑郁样行为的影响
肥胖组游泳时间、攀爬时间显著减少，不动时间（205.5 ± 9.35 s）较对照组（147.5 ± 18.91 s）和FL组（147.8 ± 8.84 s）显著增加（p < 0.001）。FO组游泳时间（93.50 ± 10.65 s，p < 0.01）和攀爬时间（10.17 ± 1.17 s，p < 0.05）显著增加，不动时间（183.0 ± 9.59 s）显著低于肥胖非断食组（p < 0.05）。FO组游泳时间和攀爬时间仍显著低于FL组（p < 0.01），不动时间显著高于对照组和FL组（p < 0.001）。对照组与FL组间均无显著差异（p > 0.05）。
### IF对记忆的影响
改良T迷宫测试显示，肥胖组正确选择百分比（30.56 ± 13.61%）较对照组（62.50 ± 15.59%，p < 0.01）和FL组（69.44 ± 13.61%，p < 0.001）显著降低。FO组（56.94 ± 9.74%）较肥胖非断食组显著逆转该改变（p < 0.05），与对照组和FL组比较无显著差异（p > 0.05）。对照组与FL组间无显著差异（p > 0.05）。
### IF对炎症和氧化应激标志物的影响
HFD显著增加血清和脑匀浆中TNF-α和IL-1β水平（与对照组比较：血清p < 0.001，脑匀浆p < 0.01和p < 0.001）。FO组血清TNF-α和IL-1β（p < 0.001）及脑匀浆（p < 0.01）较肥胖非断食组显著降低，但血清水平仍高于对照组和FL组（p < 0.01），脑IL-1β亦高于对照组（p < 0.05）和FL组（p < 0.01）。脑TNF-α水平在对照组、FL组和FO组间无显著变化（p > 0.05）。氧化应激方面，肥胖组MDA较对照组和FL组显著增加（p < 0.001），伴随脑SOD显著降低（p < 0.01，p < 0.001）。FO组MDA显著降低，SOD显著升高（p < 0.001，p < 0.05）。FO组MDA仍高于对照组和FL组（p < 0.001），SOD低于FL组（p < 0.05），与对照组无显著差异。FL组脑MDA低于对照组（p < 0.001），SOD无显著差异。
### IF对脑BDNF的影响
肥胖非断食组脑BDNF较对照组（p < 0.05）和FL组（p < 0.001）显著降低。FO组BDNF高于肥胖组（p < 0.05），但低于FL组（p < 0.01），与对照组无显著差异（p > 0.05）。FL组BDNF较对照组显著增加（p < 0.01）。
### IF对组织病理学发现的影响
对照组和FL组大脑皮层神经元、胶质细胞、神经纤维网和血管组织形态正常。肥胖组皮层可见大量固缩神经元、变性神经元伴胶质细胞聚集、脑血管充血伴出血。FO组皮层组织学改变改善，固缩神经元数量减少。半定量评分显示，肥胖组固缩神经元、卫星现象、脑血管充血和出血评分显著高于对照组和FL组（p < 0.001）。海马H&E染色显示，对照组和FL组海马角回（cornu ammonis, CA）三层结构（多形细胞层、锥体细胞层和外分子层）正常。肥胖组锥体细胞层大量固缩神经元伴深嗜碱性核，外分子层空泡变。FO组锥体细胞层少量固缩神经元伴透明间隙。两位独立观察者组织学评分一致性极佳，绝对一致率100%，加权Cohen’s Kappa = 1.000，组内相关系数（intraclass correlation coefficient, ICC
(2,1)）= 1.000。
### IF对免疫组织化学分析的影响
大脑皮层Beclin-1免疫染色：对照组和FL组表达极少；肥胖组大量神经元呈强阳性胞质表达；FO组少量免疫染色细胞，表达轻度。P62染色：对照组和FL组表达极少；肥胖组大量阳性染色细胞；FO组少量阳性标记细胞。皮层Beclin-1和p62表达面积百分比在肥胖组较对照组和FL组显著增加（p < 0.001）；FO组较肥胖非断食组显著降低（p < 0.01）。FO组Beclin-1表达仍高于对照组（p < 0.05）和FL组（p < 0.01）；p62在控制组、FL组和FO组间无显著差异（p > 0.05）。
海马Beclin-1免疫染色：对照组和FL组锥体细胞层阴性表达；肥胖组大量神经元强阳性胞质表达；FO组少量免疫染色细胞，表达轻度。P62染色：对照组和FL组阴性；肥胖组大量阳性染色细胞；FO组少量阳性标记细胞。海马Beclin-1和p62表达面积百分比模式与皮层类似：肥胖组显著高于对照组和FL组（p < 0.001），FO组较肥胖非断食组显著降低（p < 0.01）。Beclin-1在FO组仍高于对照组（p < 0.05）和FL组（p < 0.05）；p62在控制组、FL组和FO组间无显著差异（p > 0.05）。
### IF对自噬蛋白mRNA表达的影响
肥胖组Beclin-1和P62 mRNA表达较对照组（p < 0.01，p < 0.001）和FL组（p < 0.01，p < 0.001）显著增加。FO组Beclin-1和P62 mRNA表达较肥胖非断食组显著降低（p < 0.05，p < 0.001）。仅P62表达高于FL组（p < 0.01）。对照组与FL组间无显著差异（p > 0.05），对照组与FO组间亦无显著差异（p > 0.05）。LC3-II和ATG5方面，肥胖组较对照组（p < 0.01，p < 0.05）和FL组（p < 0.001）显著降低。FO组较肥胖非断食组显著升高（p < 0.01，p < 0.05）。FL组LC3-II和ATG5表达高于对照组（p < 0.01）和FO组（p < 0.01）。
## 讨论与结论
HFD诱导的肥胖是全球重大健康问题，与神经炎症和认知功能损伤密切相关。本研究发现，与正常饮食对照组相比，HFD摄入导致认知功能下降，具体表现为Crawley社会性测试中社交动机和新奇性受损、强迫游泳测试中抑郁样行为增加，以及改良T迷宫中记忆性能下降。HFD administration 8周显著产生全身和局部脑炎症及氧化应激状态，表现为炎症介质IL-1β、TNF-α和氧化应激标志物MDA增加，SOD降低。
IF干预在HFD喂养大鼠中显示出认知保护作用，推荐通过减少炎症和氧化应激过程对HFD诱导代谢紊乱产生有益影响，伴随H&E分析切片中固缩神经元、卫星现象和出血等组织学改变减少。IF通过减少神经炎症和抑制血脑屏障破坏改善HFD诱导的记忆缺陷。同时，神经炎症影响脑中BDNF信号。本研究HFD脑匀浆显示BDNF表达显著降低。BDNF是中枢神经系统可塑性的重要神经营养因子，参与神经精神障碍的发病机制。短期而言，BDNF通过突触后修饰影响突触可塑性；长期而言，调控突触蛋白合成、神经元生长分化、细胞存活、长时程增强和突触可塑性。FL组BDNF高于对照组，可由禁食期间酮体（β-羟基丁酸）激活cAMP/PKA/p-CREB信号通路促进海马BDNF转录解释。
自噬障碍参与神经退行性疾病发病。Beclin-1是启动自噬体的关键分子，LC3β是巨自噬（macro-autophagy）必需的微管相关蛋白，ATG5参与自噬体形成。本研究中，肥胖组大脑皮层和海马Beclin-1、p62免疫和mRNA表达增加，伴随LC3-II和ATG5 mRNA降低，提示自噬流受损而非自噬激活。这与HFD小鼠肝组织中p62增加、LC3 I/II和ATg降低的先前期发现一致。然而，FO组较肥胖非断食动物显示这些参数的逆转。禁食减少Beclin-1与前期研究一致：即使健康个体禁食一个月后的Beclin-1表达降低，对避免健康组织不必要凋亡很重要，而不降低基础自噬过程。此外，IF通过Beclin-1/p62调节改善自噬，保护免受年龄诱导的良性前列腺增生。Beclin-1可能在早期促进自噬，但由于自噬后伴随溶酶体融合和内容物降解，这不意味着HFD喂养小鼠具有更好的自噬系统。HFD喂养小鼠心脏组织显示更多自噬体但更少的自噬溶酶体，提示自噬形成正常甚至增加，但自噬流受抑。同样，两周禁食增强Beclin-1表达并激活自噬，但一个月禁食后Beclin-1降低，表明Beclin-1在自噬中的动态复杂功能。p62在分子聚集体和疾病进展中形成聚集体并积累，可作为自噬抑制指标和下游自噬体通路缺陷指标。
本研究强调自噬系统对正常脑功能的重要性，显示IF对HFD诱导认知障碍具有预防作用，可能由大脑皮层和海马自噬功能障碍介导。未来研究可通过分析Beclin-1、p62和LC3表达之间的复杂关系，识别伴有认知障碍的肥胖患者。将这些分析应用于雌性动物以探究HFD和IF脑反应的潜在性别差异也将非常有趣。
研究局限性包括：样本量小（n=6）可能限制统计效能和结果推广性；仅采用单一IF模式（每周非连续三日24小时断食），未能捕捉不同断食方案的潜在变异性；虽评估mRNA表达和免疫组织化学定位，但未进行定量蛋白水平分析；依赖自噬标志物的静态测量（仅检测LC3-II mRNA），未能完全捕捉自噬流的动态特性。未来研究应包含LC3-II/LC3-I蛋白分析和溶酶体抑制剂自噬流检测，以更好表征自噬活性。此外，未评估IF的长期效应，研究结果仅反映短期分子和组织学改变。
**结论**：IF对HFD诱导的认知障碍具有预防作用，可能由大脑皮层和海马自噬功能障碍介导，强调自噬通路对正常神经元功能的重要性。这些结果提示，IF通过调控自噬功能保护肥胖大鼠神经系统免受HFD诱导的炎症和氧化应激，对神经元存活至关重要。未来研究应纳入定量蛋白分析以验证转录和组织学发现，并开展纵向研究评估IF对自噬、组织完整性和功能结局的短期和长期影响。
