牛血清白蛋白-γ-环糊精结合物的制备及其对紫杉醇的增溶作用和递送性能

何文鑫|宋启军|刘庆远|陈星月|谭淑银|张洪涛

江南大学化学与材料工程学院，中国无锡，214122

摘要

本研究制备了牛血清白蛋白-γ-环糊精（BSA-CD）结合物，以探讨其对紫杉醇（PTX）的增溶效果及其作用机制。水溶性研究表明，当0.1 mM的BSA-CD结合物与4 mM的PTX形成复合物时，PTX的最大水溶性达到34 mM，比临床制剂Abraxane™的高出约5倍，药物载药量也增加了约2.8倍。体外释放实验表明，在pH 7.4条件下，该包合物在72小时内累计释放了约14%的PTX；而在pH 5.5条件下，释放量约为23%，显示出pH响应性的释放特性。MTT实验确认BSA-CD载体无细胞毒性；在10 μM浓度下，该包合物对黑色素瘤B16F10细胞的细胞毒性优于游离PTX和Abraxane™。本研究证实，通过BSA的疏水口袋和γ-CD的疏水腔的协同“双重包封”作用，以及特定离子强度调控下的适度聚集状态，显著提高了PTX的水溶性和递送效率，为疏水性抗癌药物的制剂优化提供了新的方法和思路。

引言

药物递送系统的优化是生物技术领域的核心挑战，尤其是对于占临床药物60%以上的疏水性化合物而言。这些药物通常具有较差的水溶性、低生物利用度和显著的毒性副作用，严重影响了其临床疗效（Kalepu & Nekkanti, 2015）。紫杉醇（PTX）是从Taxus brevifolia树皮中提取的二萜类天然产物，因其能加速微管聚合并抑制有丝分裂纺锤体形成而成为晚期卵巢癌、乳腺癌和皮肤癌的一线化疗药物（Sharma, Balasubramanian, & Straubinger, 1995）。然而，PTX具有极强的疏水性，水溶性仅为0.25–0.60 μg/mL，几乎不溶于常见溶剂，这成为其临床应用的关键瓶颈（Bilensoy, Gürkaynak, Ertan, Şen, & Hıncal, 2008）。

为了解决溶解性问题，最初的临床制剂Taxol®采用了Cremophor EL®和乙醇（1:1体积比）的混合溶剂。但Cremophor EL®会导致高达40%的患者出现过敏反应，需要预先使用皮质类固醇和抗组胺药，从而影响用药安全性（Zhou, Liu, Yu, Shafiq, & Qiao, 2024）。随后推出的白蛋白结合制剂Abraxane™通过白蛋白纳米悬浮技术实现了在肿瘤组织中的靶向积累（Miele, Spinelli, Miele, Tomao, & Tomao, 2009）。然而，其制备过程中残留的氯仿会导致慢性毒性，且每剂成本较高，加之由于生物分布不均和过长的半衰期（21.6小时）以及12,000 M⁻¹的结合常数，仍存在骨髓抑制的风险（Li, Zhao, Liang, Yan, & Sun, 2022）。其他改良制剂，如PTX-谷氨酸聚合物结合物Xyotax™，未能有效释放出游离药物，导致临床疗效不足和严重的血液毒性，最终终止了研发（Boddy, 2007）。这些案例表明，单一载体系统难以同时解决溶解性、毒性和生物利用度的难题。

环糊精（CDs）作为经典的分子复合剂，具有锥形腔体（疏水核心/亲水表面），可通过范德华力和氢键包裹疏水性分子，已被广泛用于提高难溶性药物的溶解性（He et al., 2013）。其中，由8个葡萄糖单元组成的γ-环糊精（γ-CD）的腔体尺寸（内径0.75 nm）与PTX的分子结构高度匹配，可实现药物分子的完全嵌入（Omtvedt et al., 2021）。然而，未修饰的γ-CD与PTX形成的包合物结合常数仅为785 M⁻¹；尽管改性衍生物如羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）可将PTX的溶解性提高2×10³倍以上（Chen, Zhou, Ren, & Yan, 2005），但这些基于单环糊精的载体仍存在生物分布不佳和靶向能力不足的问题。

血清白蛋白是脊椎动物血浆中的主要蛋白质，具有构象适应性强、可生物降解和制备工艺成熟等优点（Jahanban-Esfahlan et al., 2019）。其中，牛血清白蛋白（BSA）因其低成本、易获取性、17对稳定的二硫键和高赖氨酸含量以及稳定的理化性质而成为药物载体的优选材料（Jahanban-Esfahlan & Panahi-Azar, 2016）。Kono等人通过分子间二硫键制备了BSA纳米颗粒，其胶体稳定性和药物释放特性优于Abraxane™（Kono, Sugaya, Yasudome, Ogiso, & Ogawara, 2024）。然而，单一白蛋白载体的增溶能力有限，且缺乏靶向肿瘤的机制。线性寡糖-白蛋白结合物（如葡聚糖-BSA）虽能实现协同增溶，但线性糖链缺乏特异性腔体结构，仅通过氢键和疏水相互作用发挥作用，导致溶解度提升仅1.8–2.3倍，难以满足临床需求（Zhang et al., 2019）。

目前关于“环状糖-蛋白质”复合载体对PTX的增溶效果的研究尚不充分。环状寡糖可通过其独特的腔体结构与白蛋白的疏水结合位点协同作用，有望构建突破单一载体局限性的“双重包封”系统。基于此，我们以γ-CD为原料，通过磺酰化、叠氮化、胺化和溴化四步反应序列，合成了短烷基链修饰的γ-环糊精衍生物（γ-CD-Br）。随后将其通过BSA Cys34残基上的巯基与溴基特异性结合，得到牛血清白蛋白-γ-环糊精（BSA-CD）结合物。我们假设在碳酸氢钠缓冲液提供的弱碱性条件下，BSA的疏水结合口袋和γ-CD的疏水腔体可发生协同构象变化，从而显著提高PTX的包封效率。通过MALDI-TOF-MS、FTIR、¹H NMR和¹³C NMR等技术验证了该结合物的结构，并系统研究了其对PTX的包载能力和增溶效果。Pei等人（2017）利用UV–Vis、圆二色性（Bhatt et al., 2018）和¹H NMR（Liu et al., 2003）等技术确认了BSA-CD-PTX包合物的结构和性能。本研究旨在开发一种具有高增溶效率、低毒性和良好生物相容性的新型递送载体，为疏水性抗癌药物的制剂提供新思路。

章节摘录

材料

BSA购自上海Aladdin生化科技有限公司。γ-CD购自上海Meryer生化科技有限公司。Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride（TCEP·HCl）购自苏州Gretag制药科技有限公司。PTX购自上海Titan科技有限公司。其他试剂购自上海新华制药试剂有限公司。

γ-CD衍生物的合成

合成过程如下

γ-CD衍生物的合成与表征

环糊精的6位羟基具有高反应性（Khan, Forgo, Stine, & D'Souza, 1998），可引入溴乙酰胺基团（-NHCO-CH₂-Br）。合成步骤包括对γ-CD进行磺酰化（Novokshonov, Xuan, & Shaglaeva, 2019）、叠氮化（γ-CD-N₃）、还原（γ-CD-NH₂）（Tang & Ng, 2008）和溴化（γ-CD-Br，产率：35.2%）。

如图2(A)所示，γ-CD衍生物的分子量与理论值一致

结论

本研究设计并制备了BSA-CD结合物载体。通过四步特异性合成策略合成了γ-CD-Br，利用BSA表面Cys34位点的巯基实现了82%的有效接枝率，形成了兼具蛋白质生物相容性和环糊精分子包封特性的“环状糖-蛋白质”杂化系统。粒径和ζ电位分析表明，在20–50 mM NaHCO₃缓冲液中

CRediT作者贡献声明

何文鑫：撰写——初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。宋启军：撰写——审稿与编辑、项目监督、概念构思。刘庆远：软件开发、方法学设计、数据整理。陈星月：结果验证、数据整理。谭淑银：方法学设计、实验实施、数据整理。张洪涛：结果验证、项目监督、资金筹措。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国中央科技发展引导资金计划（编号：2024ZY0077）的支持。