可电离脂质纳米颗粒(Ionizable lipid nanoparticles, LNPs)是临床递送信使RNA(mRNA)或小干扰RNA(siRNA)等核酸药物的首要方法，其封装及共递送小分子治疗药物的能力尚待深入探索。开发基于LNPs的双重递送策略对治疗易发生耐药的恶性肿瘤具有重要潜力。B细胞急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)是一种血液系统恶性肿瘤，复发或标准治疗无效的患者的预后较差。本研究将抗有丝分裂剂单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E, MMAE)封装于已含非功能性阴性对照siRNA的预制LNPs中，并在B-ALL临床前模型中评估其抗白血病活性。研究人员优化了制备后装载(postfabrication loading)技术，在维持LNPs优良siRNA滞留率及有利理化特性的同时实现MMAE包封。流式细胞术及共聚焦显微镜证实B-ALL细胞通过网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis)和巨胞饮作用(macropinocytosis)摄取LNPs。负载MMAE的LNPs在体外对B-ALL细胞表现出比标准治疗药物长春新碱(vincristine)更强的抗白血病效力。此外，在B-ALL人源异种移植小鼠模型中，与不含MMAE的LNPs相比，MMAE-LNPs使脾脏及外周血中的白血病负荷降低2倍以上。综上，本研究为开发可作为临床转化性共递送平台、同时携带化疗药与siRNA以改善B-ALL等难治性恶性肿瘤治疗的LNPs奠定了基础。
论文解读：利用可电离脂质纳米颗粒递送单甲基澳瑞他汀E治疗B细胞急性淋巴细胞白血病的研究
研究背景与意义
可电离脂质纳米颗粒（Ionizable Lipid Nanoparticles, LNPs）是目前临床上用于安全有效递送核酸治疗药物（如mRNA疫苗及用于肝脏疾病的siRNA）的主流非病毒载体。传统脂质体已在临床成功用于包裹小分子化疗药物（如阿霉素脂质体、柔红霉素/阿糖胞苷复方脂质体），但可电离LNPs除包载核酸外能否共递送化疗药物仍处于探索阶段。B细胞急性淋巴细胞白血病（B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia, B-ALL）是最常见的儿童恶性肿瘤亚型，虽然初治患者5年总体生存率可达近90%，但复发或难治性（R/R）患者预后极差，残留于骨髓微环境等的白血病细胞易发展出化疗耐药。现有长春新碱脂质体制剂（Marqibo®）因上市后确证性试验招募困难已主动撤市，使R/R B-ALL治疗存在缺口。单甲基澳瑞他汀E（Monomethyl Auristatin E, MMAE）是一种微管聚合抑制剂，作用机制类似于长春新碱，目前主要作为抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）弹头使用，其强疏水性与可电离特性使其适合载入脂质基纳米粒。本研究旨在探究可电离LNPs能否在保留siRNA包载与滞留的前提下有效装载并递送MMAE治疗B-ALL，为化疗-核酸联合治疗的临床转化平台提供基础。该论文发表于《ACS Omega》。
主要关键技术方法
研究人员采用受限射流碰撞混合器（Confined Impingement Jet, CIJ mixer）进行闪速纳米沉淀（Flash Nanoprecipitation, FNP）制备含阴性对照siRNA（NC-siRNA）的MC3系可电离LNPs（摩尔比DLin-MC3-DMA:胆固醇:DSPC:DMG-PEG2000= 50:38.5:10:1.5，N:P比6–10）。优化MMAE制备后装载法：将预制siRNA-LNPs透析至0.1 M碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液（pH 10.6–11.0），浓缩后按药物/脂质比（Drug-to-Lipid Ratio, D/L）加入MMAE甲醇溶液孵育，超滤去除未包封药物。使用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）、冷冻透射电镜（Cryo-TEM）、TNS荧光法测表观pKa、LC-MS/MS定量MMAE、QuantiFluor RNA系统测定siRNA包封率。体外采用人B-ALL细胞系REH（低危）和SUPB15（高危），通过内吞抑制剂（氯丙嗪CPZ抑制网格蛋白介导内吞、阿米洛利AMIL抑制巨胞饮）、流式细胞术及共聚焦显微镜评估摄取机制与siRNA释放；CCK-8类CellTiter-Glo法测细胞活力得IC50。体内进行BALB/c小鼠生物分布实验（包载吲哚菁绿ICG的LNPs经尾静脉给药，IVIS成像）及NSG小鼠REH细胞人源异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX模型简化版）白血病负荷疗效实验（流式检测hCD19+CD45+细胞比例），监测体重与毒性。
研究结果
2.1. MMAE Can Be Readily Loaded within Prefabricated LNPs Containing siRNA
在FNP过程中同步加入MMAE因酸性条件下MMAE质子化导致包封率仅约3.3%。改用预制siRNA-LNPs在PBS（pH 7.4）中进行制备后装载，包封率仍低（2.2%–3.3%），药物负载量（Drug Loading Capacity, DLC）最高仅0.2%。将缓冲液换为pH 10.6–11.0碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液使MMAE以非离子态存在，D/L=0.015时包封率提升3倍、DLC提升2.9倍。增加载样时总脂质质量可进一步提高包封率。最终优化条件（D/L=0.06，总脂质10–15 mg，pH≈10.8碳酸盐缓冲液）获得MMAE-siRNA共载LNPs（MMAE-LNPs），MMAE包封效率达27.3±1.5%，DLC达1.5±0.1%（较初始提高7.5倍），且siRNA相对包封率>95%，保留92% siRNA于LNPs中。4℃储存1个月后粒径维持95%，保留91% siRNA及62% MMAE；37℃胎牛血清中48小时MMAE释放<15%。
2.2. MMAE-Loading Does Not Impact Physicochemical Characteristics or siRNA Loading in LNPs
MMAE装载后LNPs流体力学直径维持120–130 nm，多分散指数（Polydispersity Index, PDI）<0.3，Cryo-TEM显示球形形态无改变。表观pKa分别为5.6（-MMAE）与5.5（+MMAE），生理pH下ζ电位均为近中性（0至-10 mV），说明MMAE不影响LNPs电离特性与表面电荷。siRNA包封率>95%，装载及透析后保留92%，表明MMAE共载不破坏siRNA包封稳定性。
2.3. siRNA-LNPs Display In Vitro Uptake by B-ALL Cells via Clathrin-Mediated Endocytosis and Macropinocytosis
空载siRNA-LNPs在1–100 nM浓度下孵育REH和SUPB15细胞72小时，细胞存活率>80%，证明载体本身无明显毒性。用DiD标记LNPs，经氯丙嗪（CPZ）或阿米洛利（AMIL）预处理后，REH细胞DiD中位荧光强度（Median Fluorescent Intensity, MFI）分别显著降低37%和41%，SUPB15细胞分别降47%和35%（p<0.05），共聚焦显微图像印证此现象，表明B-ALL细胞通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮两种途径摄取LNPs。Cy5-siRNA-LNPs随时间（1、4、24 h）在细胞内累积增加，24小时后REH细胞中77±14% Cy5-siRNA定位于溶酶体外，说明发生有效内涵体逃逸（endosomal escape）。
2.4. MMAE-LNPs Exhibit Potent In Vitro Antileukemic Activity against B-ALL Cell Lines
游离MMAE、MMAE-LNPs与标准治疗药物长春新碱（vincristine）分别处理REH和SUPB15细胞48小时。MMAE及MMAE-LNPs的IC50均为1–2 nM，显著低于长春新碱（REH: 99.5 nM；SUPB15: 79.1 nM）。MMAE与MMAE-LNPs剂量-存活曲线IC50统计学上有差异（p<0.05）但差值<5 nM，生物学上无显著差异，说明LNP包载未削弱MMAE体外抗白血病活性，其胞内释放可保持药效。
2.5. MMAE Encapsulation Does Not Alter the Biodistribution of LNPs In Vivo
BALB/c小鼠尾静脉注射包载ICG的LNPs（±MMAE），4 h和24 h离体器官IVIS成像显示两组器官荧光分布无显著差异，均主要富集于肝脏继而脾脏，符合载脂蛋白E（Apolipoprotein E, ApoE）吸附致单核吞噬系统（Mononuclear Phagocyte System, MPS）摄取特征。4 h信号强于24 h，提示LNPs随时间被清除（半衰期约3–5 h）。MMAE装载不改变LNPs固有生物分布，肝脾富集对靶向B-ALL髓外病变（如脾脏残留灶）可能具潜在优势。
2.6. MMAE-LNPs Exhibit a Dose-Dependent Reduction in Leukemic Burden in Human Xenograft B-ALL Mice
NSG小鼠尾静脉接种2×106REH细胞，植活后给予四次静脉给药（每3天一次）：对照组（仅NC-siRNA-LNPs）、MMAE-LNPs低剂量组（MMAE 0.02 mg/kg + NC-siRNA ≈0.3 mg/kg）、高剂量组（MMAE 0.05 mg/kg + NC-siRNA ≈0.3 mg/kg）。游离MMAE 0.1 mg/kg致小鼠体重下降10%，而MMAE-LNPs两剂量组无显著体重减轻，提示LNP包载降低全身毒性。骨髓白血病负荷（hCD19+CD45+）三组中位数分别为86%、82%、71%，未达统计学显著性，但高剂量组中2/7小鼠骨髓负荷≤1%。脾脏与外周血负荷：高剂量组脾脏白血病细胞中位数较对照组降低2.0倍（p<0.05），外周血降低6.1倍（p<0.05）。表明MMAE-LNPs在体内具剂量依赖性减瘤效果且无游离MMAE相关明显毒性，肝脾富集可能与脾脏负荷降低相关。
讨论与结论总结（翻译结论部分）
尽管脂质体可包封理化性质多样的小分子治疗药物，但其囊泡形态限制了对核酸与小分子药物的双重包封。可电离LNPs虽经精细设计以高效包埋核酸治疗药物，但利用其固体致密内部结构中的富脂域进行小分子装载尚待开发。本工作成功将MMAE与惰性siRNA共载于临床相关配方的可电离LNPs中，建立了优化的预制LNPs中MMAE包封方法，所得颗粒理化特性、稳定性及siRNA滞留均未改变。可电离LNPs可被B-ALL细胞高效摄取，抑制实验表明巨胞饮与网格蛋白介导的内吞参与摄取过程。MMAE-LNPs保留了MMAE的效价，且在B-ALL细胞中显示出优于标准治疗药物长春新碱的抗白血病活性。MMAE包载不改变LNPs固有生物分布，肝脏与脾脏为主要蓄积器官。在B-ALL人源异种移植小鼠模型中，MMAE-LNPs显著降低脾脏及外周血白血病负荷且呈剂量依赖性，未出现游离MMAE的明显全身毒性。由于本研究用药方案未能显著减少骨髓白血病负荷，结果为未来增强LNPs在骨髓中蓄积与滞留的研究提供了关键依据。鉴于微管聚合抑制的非特异性可能致脱靶效应，后续需研究对白血病细胞的靶向递送以扩大治疗窗。此外，本平台通过与功能相关siRNA联合用药有望进一步发挥协同抗肿瘤作用。综上，本研究为开发可同时共递送不同治疗模式以增强侵袭性恶性肿瘤疗效的多功能平台提供了重要基础。
