摘要
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）的发病机制尚未完全阐明，临床仍缺乏有效治疗靶点。巨噬细胞焦亡及极化失衡是UC进展的核心事件。作为焦亡的关键上游调控因子，Z-DNA结合蛋白1（Z-DNA binding protein 1, ZBP1）在UC相关巨噬细胞中的作用尚未被系统阐释。既往研究显示，Emapunil可抑制巨噬细胞炎症并下调ZBP1表达，提示其有望成为UC治疗的候选药物。
研究人员采用免疫荧光检测UC患者及葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate, DSS）诱导的结肠炎小鼠结直肠组织中ZBP1的表达及定位；通过过表达、敲低ZBP1及Emapunil干预巨噬细胞，分析其对焦亡、极化、核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）通路及肠屏障功能的影响；并通过体外及体内实验验证Emapunil对UC的治疗作用及机制。
结果显示，ZBP1在UC患者结直肠巨噬细胞中显著上调。过表达ZBP1可诱导巨噬细胞焦亡及M1型极化，激活NF-κB通路并破坏肠上皮屏障完整性；而敲低ZBP1可明显逆转上述效应。Emapunil通过靶向18 kDa线粒体移位蛋白（mitochondrial translocator protein, TSPO），有效下调ZBP1表达，抑制巨噬细胞焦亡及促炎极化，减轻DSS诱导的小鼠结肠损伤并保护肠屏障功能。
研究表明，ZBP1通过驱动巨噬细胞焦亡及促炎极化加重肠道炎症及屏障损伤，是调控UC中巨噬细胞异常活化的新型关键分子。Emapunil通过靶向TSPO下调ZBP1发挥抗UC作用，为UC的临床诊疗提供了新的机制见解与潜在治疗策略。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。
论文解读
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）的主要亚型之一，为一种慢性特发性胃肠道黏膜炎症性疾病。尽管生物制剂等靶向治疗已取得一定进展，但其发病机制仍未完全明确，现有治疗手段仍面临缓解率有限、复发率高的临床困境。近年研究发现，程序性细胞死亡在炎症性疾病中发挥关键作用，其中焦亡（pyroptosis）是一种由gasdermin家族蛋白介导的促炎性程序性细胞死亡，依赖炎症小体活化，伴随白细胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18等大量促炎因子释放及质膜孔形成，可加剧局部炎症与组织损伤。在UC患者结直肠黏膜及结肠炎实验模型中，已观察到过度炎症小体活化及焦亡相关蛋白表达上调，提示肠道上皮细胞与免疫细胞的异常焦亡可能参与肠屏障破坏、免疫激活失调及持续炎症状态的形成。
Z-DNA结合蛋白1（Z-DNA binding protein 1, ZBP1，又称DAI或DLM-1）是胞质内天然免疫核心传感器，也是焦亡的关键上游起始因子，可特异性识别异常内源性或病原体来源的Z型核酸，激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）炎症小体，诱导半胱天冬酶1（caspase-1）裂解为p20活性形式，进而切割gasdermin D（GSDMD）生成N端片段（GSDMD-NT），介导质膜孔形成并触发焦亡，同时促进IL-1β等促炎因子成熟释放。既往研究多聚焦于ZBP1在B细胞、自然杀伤细胞及CD8+ T细胞中的免疫调控功能，其在UC核心免疫细胞——巨噬细胞中的作用尚不明确。虽有研究报道UC患者结直肠上皮细胞中ZBP1表达升高，但针对免疫尤其是巨噬细胞的研究尚属空白。巨噬细胞在IBD炎症的启动、维持及消退中起核心作用，其可向促炎M1表型极化，释放肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α、IL-1β、IL-6等因子，直接诱导组织损伤并破坏肠上皮屏障完整性。近期研究提示UC中存在巨噬细胞焦亡，且可通过驱动M1极化放大促炎反应，但ZBP1介导的焦亡通路在UC巨噬细胞中的作用机制亟待系统探究。
既往转录组测序显示，Emapunil（XBD-173）可抑制脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的巨噬细胞炎症反应并显著下调ZBP1表达，通路富集分析与IBD相关信号通路密切相关。Emapunil是一种口服选择性18 kDa线粒体移位蛋白（mitochondrial translocator protein, TSPO）配体，最初开发用于抗焦虑，已在神经疾病临床前模型中显示出抗炎与神经保护作用，并被证实可通过调节巨噬细胞功能抑制骨关节炎炎症。基于此，研究人员提出Emapunil可能通过调控巨噬细胞ZBP1缓解UC的科学假说。
本研究共纳入12例活动期UC患者及12例年龄匹配的健康对照者结直肠组织样本，所有样本均经伦理审查并通过结肠镜采集。动物实验采用6~8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠，随机分为对照组、DSS诱导UC组及DSS+Emapunil干预组，通过3% DSS饮水7天构建结肠炎模型，干预组同步每日腹腔注射0.3 mg/kg Emapunil，连续给药7天后评估疾病表型。细胞实验采用人单核细胞白血病THP-1细胞，经佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）诱导分化为成熟巨噬细胞后，以LPS刺激建立M1极化模型，分别进行ZBP1过表达、siRNA敲低及Emapunil干预；通过Transwell共培养体系模拟巨噬细胞与肠上皮Caco2细胞的相互作用。关键技术方法包括：临床样本免疫荧光染色、巨噬细胞基因操作（过表达/敲低）、Transwell共培养、组织病理学与免疫荧光分析、蛋白质印迹（western blot）、实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-qPCR）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）及mRNA转录组测序分析。
ZBP1在UC结直肠巨噬细胞中上调
免疫荧光分析显示，UC患者结直肠组织中ZBP1表达显著升高，且与巨噬细胞标志物CD68共定位程度远高于上皮细胞，表明ZBP1上调在巨噬细胞中更为突出。体外实验中，LPS刺激诱导THP-1细胞向M1型极化（CD80表达升高）的同时，ZBP1 mRNA水平亦显著上调。
ZBP1诱导巨噬细胞焦亡并促进向M1表型极化，激活NF-κB通路
在THP-1细胞中过表达ZBP1后，蛋白质印迹检测到NLRP3、GSDMD-NT、caspase-1 p20等焦亡相关蛋白水平升高，同时NF-κB通路活化标志p-ERK、IKBA表达增加；RT-qPCR结果显示CD80、IL-1β、IL-6转录水平显著上升，提示ZBP1过表达可诱导巨噬细胞焦亡、M1极化及通路活化。反之，siRNA敲低ZBP1可有效抑制LPS刺激的巨噬细胞中上述焦亡、M1极化及通路活化表型。
ZBP1过表达的巨噬细胞破坏肠上皮屏障完整性
ELISA检测显示，ZBP1过表达的THP-1细胞培养上清中IL-1β、IL-6浓度显著升高。Transwell共培养实验中，与ZBP1过表达巨噬细胞共培养的Caco2细胞，其紧密连接蛋白闭锁蛋白（occludin）与闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）的蛋白质印迹及免疫荧光信号均显著降低，分布紊乱，证实高ZBP1巨噬细胞可通过分泌促炎因子破坏肠上皮屏障。
Emapunil抑制ZBP1介导的巨噬细胞焦亡及促炎反应
重分析既往LPS刺激的RAW264.7细胞Emapunil处理转录组数据，发现ZBP1基因显著下调，差异基因KEGG富集显示IBD相关通路显著富集。细胞毒性实验确定0~600 ng/mL为Emapunil安全浓度范围，该范围内其抑制M1极化的作用呈浓度与时间依赖性。蛋白质印迹与RT-qPCR结果显示，Emapunil可显著下调LPS或ZBP1过表达诱导的ZBP1、NLRP3、GSDMD-NT、caspase-1 p20表达及NF-κB通路活化，并降低CD80、IL-1β、IL-6转录水平，证实其抗炎作用依赖于ZBP1下调。
Emapunil逆转ZBP1过表达巨噬细胞诱导的肠上皮屏障损伤
ELISA显示Emapunil可降低ZBP1过表达巨噬细胞上清中IL-1β、IL-6水平。Transwell共培养中，Emapunil处理显著提升共培养Caco2细胞的occludin与ZO-1表达及正常分布。敲低TSPO则基本取消Emapunil对ZBP1、焦亡相关蛋白的抑制作用及对紧密连接蛋白的保护作用，表明Emapunil通过TSPO依赖方式下调ZBP1。
Emapunil改善DSS诱导的小鼠结肠炎
在DSS结肠炎模型中，Emapunil干预显著减轻小鼠体重下降、便血症状，降低疾病活动指数（disease activity index, DAI）评分，缓解结肠缩短及腹腔病理改变，证实其体内治疗效果。
Emapunil减轻DSS诱导结肠炎小鼠结直肠组织损伤并保护肠屏障完整性
组织学分析显示，Emapunil明显改善DSS诱导的炎症细胞浸润、黏膜溃疡及隐窝破坏，减少杯状细胞丢失。免疫荧光染色显示Emapunil有效维持结肠组织中ZO-1与occludin的正常表达与分布，保护肠上皮屏障。
Emapunil抑制DSS诱导结肠炎小鼠结直肠巨噬细胞ZBP1介导的焦亡及M1极化
血清ELISA显示Emapunil降低DSS小鼠血清IL-1β、IL-6水平。结肠组织免疫荧光共染色显示，DSS建模后巨噬细胞F4/80与ZBP1、GSDMD、iNOS共阳性比例显著升高，Emapunil干预则显著逆转上述变化，证实其通过抑制结肠巨噬细胞ZBP1表达，阻断焦亡与M1极化。
讨论与结论
本研究首次系统阐明了ZBP1在UC进展中结直肠巨噬细胞的表达模式与调控作用，证实Emapunil通过TSPO依赖的方式靶向巨噬细胞ZBP1通路缓解结肠炎症，为UC提供了新的机制见解与潜在治疗策略。讨论部分指出，既往ZBP1在UC中的研究局限于上皮细胞，本研究填补了其在巨噬细胞功能调控的空白，明确了ZBP1作为焦亡与极化双重通路的整合分子，是UC治疗的新兴靶点。Emapunil此前已在神经与骨关节疾病中显示抗炎作用，本研究首次将其治疗潜力拓展至UC领域。研究同时指出局限性：TSPO调控ZBP1的具体分子机制未完全阐明；体内给药剂量未进行系统量效关系优化；临床样本量较小，需更大队列验证；未评估巨噬细胞吞噬功能等潜在调控效应。
结论 ：UC发病中，结直肠巨噬细胞ZBP1异常上调，诱导焦亡并促进向M1型极化，同时激活NF-κB信号通路，共同导致促炎因子过度释放及肠上皮屏障完整性破坏，加剧结肠炎症。Emapunil通过TSPO依赖方式下调结直肠巨噬细胞ZBP1表达，抑制ZBP1介导的焦亡与M1极化，阻断NF-κB通路活化，减少促炎因子分泌，保护肠上皮屏障，从而发挥抗UC治疗作用。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。
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