丝素支架在MechanoCulture T6®生物反应器加载作用及酶降解作用下的机械与结构响应

伊丽莎白·L·艾克曼（Elizabeth L. Aikman）|莉莉亚·Y·拜伦（Llia Y. Byron）|凯瑟琳·A·贝沙伊（Cathrine A. Beshay）|雅各布·A·乌尔比纳（Jacob A. Urbina）|阿尼·N·戴维斯（Ani N. Davis）|奥斯汀·M·埃文斯（Austin M. Evans）|惠特尼·L·斯托佩尔（Whitney L. Stoppel）

佛罗里达大学化学工程系，盖恩斯维尔，佛罗里达州

摘要

丝素纤维蛋白是一种半结晶生物聚合物，来源于家蚕（Bombyx mori）的茧，可以制成各种生物材料，包括排列有序的多孔支架。丝素纤维蛋白是一种理想的生物材料聚合物，因为它具有可调的孔径和机械性能，这些性能与排列有序的软组织相匹配，同时它还具有生物相容性、无毒性以及可调控的降解性。这个体外平台是基于冰模板制备的各向异性丝素纤维蛋白支架开发的，旨在通过生物反应器施加机械负荷来模拟排列有序的软组织。不同的冻干后支架制备参数会导致丝素纤维蛋白氨基酸构建块的自组装方式不同，这一点通过晶体结构和体外降解实验得到了验证。X射线散射显示，当支架经过较慢的冻干处理时，其晶体域具有更长的有序结构。这种结构差异也体现在不同的酶降解速率上，其中蛋白酶XIV能够更快地切割小晶体域之间的无定形区域。MechanoCulture T6生物反应器的刺激条件为1 Hz、10%的应变持续5天、10天或25天，随后休息11.5小时，以模拟骨骼肌的肥大过程。使用水化单轴流变学方法评估了杨氏模量（E）、极限拉伸应力（UTS）和断裂应变。结果表明，机械性能和内部孔隙率不受储存条件、加载方式和时间的影响。扫描电子显微镜（SEM）和纳米计算机断层扫描（nano-CT）显示，生物反应器加载后支架的结构性质变化很小。

引言

丝素纤维蛋白是从家蚕茧中提取的天然生物聚合物，由于其生物相容性、可控的降解速率和可调的物理性质，被广泛用于生物材料的制备。1, 2, 3 丝素纤维蛋白溶液可以制成多种形式的生物材料，如薄膜、纳米颗粒、支架和水凝胶。1, 3 分子量、浓度和结晶度都是可调节的参数，它们会影响最终丝素纤维蛋白基结构的机械和物理性质。1, 2, 4 丝素纤维蛋白通过蛋白质内部的二级结构形成物理交联，从而产生结晶的β-折叠区域。5, 6, 7 β-折叠结构的有序排列通过氢键作用形成结晶态和非结晶态聚合物区域，这会随着时间的推移降低光学透明度并增加机械强度。7, 8 通过施加剪切力、添加盐分、提高温度或水蒸气退火可以有意诱导结晶β-折叠结构。然而，这些结构也可能在生物聚合物相互作用过程中无意中形成，目的是为了最小化自由能。1, 5, 7, 9, 10 β-折叠结构的数量和排列是可调的，从而可以控制降解速率、机械性能和热性能，因为非结晶态和结晶态区域的比例会发生变化。

多孔三维丝素纤维蛋白支架可以通过盐浸出1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 或冰模板技术21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 制备。冰模板技术是指将水溶液冷冻后进行冻干，使冰升华，从而留下丝素纤维蛋白支架。24 这些支架中的孔形状可以通过冷冻步骤来控制，从而形成各向同性孔或各向异性通道。23, 24, 26, 31 为了实现不同的孔结构，可以在模具中冷冻以制备各向异性支架23, 27, 31，或者在-20°C或-80°C的冷冻柜中冷冻以制备各向同性支架。4, 25, 26 以往的研究探讨了控制冷冻速率的参数空间，冷冻速率由冷冻温度决定，以此来评估孔径的各向异性。23, 31 以往关于各向同性丝素纤维蛋白支架的研究评估了其可调控的降解速率4, 32, 33 以及不同制备参数下的压缩力学性能。26, 27 最初的研究开始探索孔径的可调性23, 31 和排列有序的丝素纤维蛋白支架的机械性能，31，但各向异性支架的降解信息尚未完成。以往的努力旨在了解这些丝素纤维蛋白支架在体内使用前的动态特性，以便更好地理解生物活性分子的传递27, 34、促进细胞浸润的策略23, 25, 27 以及根据制备参数调整降解时间线的可行性。2, 4, 33

基于丝素纤维蛋白的生物材料在涉及细胞成熟、分化和重塑反应的应用中取得了成功。通过调节机械性能、结构组织和生物活性分子，可以调控细胞反应。一些例子表明，由于结构特性，干细胞能够发生分化16, 28，同时细胞还会因生物信号而发生迁移和表型变化。7, 27, 34 具体来说，早期的体外研究使用了各向异性冰模板丝素纤维蛋白支架，探讨了细胞外基质成分对细胞粘附的影响程度27 以及与细胞培养应用相关的可调力学性能27, 31。最近的研究开始关注支架体积的可扩展性和通过二级结构晶粒大小对物理性能的基本控制。31 对这些支架的可扩展性和动态时间变化的基本理解将为体外评估提供途径，包括开发三维疾病模型（杜兴氏肌营养不良症、罕见疾病）35, 36 和药物开发（药物测试）37, 38，在进行体内研究之前。例如，丝素纤维蛋白多孔支架为关键的长期体外应用提供了必要的结构支持，包括模拟和支持肌肉生长，从而能够进行心脏27 和骨骼肌31, 40, 41 组织的研究。

骨骼肌是一个动态器官，其萎缩或肥大的程度取决于系统的总信号和负荷。42, 43, 44 机械负荷和运动对骨骼肌生长至关重要，可以刺激机械转导途径中的信号级联反应。42, 45, 46, 47 虽然像I型胶原水凝胶这样的材料在短期研究中的研究可以提供关于细胞行为的见解，但需要开发新的方法（NAMs）来进行长期的功能性研究。48 长期机械转导评估需要在机械生物反应器中进行，例如CellScale MechanoCulture™ T6生物反应器、Flexcell®张力系统或定制系统。47, 49 长期培养平台的开发需要能够模拟生理相关的机械运动47，并在这些系统中了解这种运动对相关生物材料的影响。值得注意的是，Somers等人的先前工作确定了机械运动的起始时间、幅度和重复次数对三维体外骨骼肌生长增殖结果的影响。50 此外，其他骨骼肌细胞化支架在培养6到32天后形成了具有收缩能力的成熟肌肉组织，这突显了长期培养平台对于条纹肌研究的重要性。45

在这项工作中，评估了β-折叠结构与可调力学和降解速率之间的基本关系。这些努力对于开发体外新方法中的丝素纤维蛋白支架非常重要，因为它们可以提供对疾病病理学的见解，作为动物模型的替代方案。利用体外 NAMs进行的临床前研究将减轻动物实验的成本和与动物模型相关的监管变化。虽然现有的骨骼肌NAMs已被用于各种应用，但这些评估的时间范围有限。48, 51 例如，伤口愈合或疾病建模可能需要数周到数月的时间来重现相关表型。48, 51 这里的发现将为特定应用的长期材料配方选择提供依据，以便在临床前测试之前进行评估。

章节片段

去细胞化细胞外基质

采用了Stoppel等人报告的类似协议来去细胞化成年骨骼肌组织。27, 52 成年猪骨骼肌（不含抗生素的猪排）从Whole Foods Market购买。将组织切成小块（10毫米×10毫米×10毫米），然后用含有1%青霉素和链霉素（pen-strep）的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Bioreagents，匹兹堡，美国）洗涤30分钟，然后使用1%（重量/体积）十二烷基硫酸钠进行去细胞化

结果与讨论

通过各向异性冰模板技术制备的丝素纤维蛋白支架在材料的每个面上形成了不同的通道结构。21, 23, 31 制备方法和结晶诱导策略会影响机械性能以及整体孔结构。4, 7, 21, 23, 26, 55 为了进一步扩展这些材料作为新方法（NAMs）的实用性，为组织工程、再生或疾病研究提供长期的体外、临床前数据

结论

本研究确定了结晶度和长期扰动对各向异性丝素纤维蛋白支架的影响。丝素纤维蛋白支架的可调性是由冻干后的结晶诱导方法驱动的。诱导方法去除了丝素纤维蛋白聚合物主链中的结合水，导致层状β-折叠结构的形成。通过XRD确认了结晶含量和晶粒大小，并显示了这些结构内的分子间相互作用的变化

数据可用性及作者披露

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利益冲突声明

作者们没有需要报告的利益冲突。

CRediT作者贡献声明

伊丽莎白·L·艾克曼（Elizabeth L Aikman）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。莉莉亚·Y·拜伦（Llia Y. Byron）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、研究、正式分析、数据管理。凯瑟琳·A·贝沙伊（Cathrine A. Beshay）：可视化、研究、正式分析、数据管理。雅各布·A·乌尔比纳（Jacob A. Urbina）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、软件。阿尼·N·戴维斯（Ani N. Davis）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、资源管理。

利益冲突声明

☒ 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：惠特尼·L·斯托佩尔（Whitney L. Stoppel）报告称获得了美国国家普通医学科学研究所的财务支持。伊丽莎白·L·艾克曼（Elizabeth L Aikman）报告称获得了美国国家普通医学科学研究所的财务支持。莉莉亚·Y·拜伦（Llia Y. Byron）报告称获得了美国国家普通医学科学研究所的财务支持。凯瑟琳·A·贝沙伊（Cathrine A. Beshay）报告称获得了

5. 致谢与资助

Stoppel实验室想要感谢佛罗里达大学纳米尺度研究设施的研究科学家们，特别是Gary Scheiffele博士和Alison Trachet博士在提供核心设备（如FTIR和Nano-CT）方面的帮助。此外，我们还要感谢Stoppel实验室的本科生研究人员在丝素溶液制备方面的支持，包括Casey Perez、Carlos Olmeda Iniguez、Angeline Handal和Myah Massiah。

所有作者都想感谢