手性取代羰基化合物可通过老黄酶（OYE）家族烯还原酶催化的不对称烯烃还原可持续获得，但受限于低转化数（TON），OYE极少应用于放大反应。本研究利用来自嗜热链球菌（Thermus scotoductus）的耐热OYE（0.2 wt %），实现了单萜的多克级（150 g/L）不对称还原。最优结果为：(S)-香芹酮（7.5 g）转化率达90%，分离产率90%，(2R,5S)-二氢香芹酮对映体过量值（ee）>99%，TON达123,000，环境因子（E-factor）为11.6。传统不对称还原依赖氢气与金属催化剂（如Pd、Pt、Rh、Ru），成本高、毒性大且选择性不足，难以达到药物合成所需的>99% ee。均相手性配体铑、铱催化剂虽为工业首选，但负载量高（1–4 mol %）、需1–50 bar氢压，稳定性差且贵金属回收成本导致可持续性存疑。生物催化剂因高选择性、低负载量、温和条件及短合成路线成为理想替代，其中OYE含非共价结合的黄素单核苷酸（FMN）辅基，通过双-双乒乓机制，利用NAD(P)H提供氢负离子，实现活化烯烃的不对称还原，可生成最多两个手性中心。此前OYE催化反应底物浓度普遍偏低，已报道的克级还原TON仅为10³–10⁴，全细胞催化甚至低于1000。工业可行生物催化放大的标准包括：24 h内转化率>95%、ee>99.5%、底物浓度>100 g/L、底物/酶比>50、酶负载量<2 wt %、辅因子浓度<0.5 g/L、TON>10⁴。本研究选用耐热ERED TsOYE，结合葡萄糖脱氢酶（GDH）辅酶再生体系或合成烟酰胺辅酶类似物（NCBs，如BNAH、AmNAH），以单萜香芹酮为底物，考察助溶剂、底物浓度（最高150 g/L）、酶浓度、TON、辅因子稳定性及循环使用，并以环境因子评估可持续性，同时开发原位核磁共振（NMR）监测方法。
研究背景与意义
不对称烯烃还原是制备手性烷烃的关键途径，其产物是药物、农用化学品及香料等精细化学品的核心砌块。传统工艺依赖金属催化氢化，存在成本高、毒性大、选择性不足及贵金属回收困难等可持续性问题。生物催化凭借高选择性、温和反应条件及短合成路线成为极具潜力的替代方案，其中老黄酶（Old Yellow Enzyme, OYE）家族的烯还原酶（ene-reductase, ERED）可催化活化烯烃不对称还原，生成最多含两个手性中心的产物。然而，OYE在工业应用中长期受限于低转化数（turnover number, TON），且已有克级反应的TON普遍处于10³–10⁴量级，难以满足工业化标准。针对这一瓶颈，荷兰代尔夫特理工大学研究团队在《Organic Process Research & Development》发表研究，选用来自嗜热链球菌（Thermus scotoductus）的热稳定OYE（TsOYE），系统优化反应体系，成功实现多克级、高TON的不对称烯烃还原，为生物催化在工业级不对称合成中的应用提供了重要范例。
关键技术方法
研究人员首先在大肠杆菌中重组表达并纯化TsOYE，通过热纯化步骤获得高纯度、FMN饱和的酶制剂。以小分子模型底物环己烯酮及目标底物香芹酮表征酶的最适温度与pH。采用紫外-可见光谱法测定不同缓冲体系与pH下天然辅因子（NADPH、NADH）及合成烟酰胺辅酶类似物（如1-苄基-1,4-二氢烟酰胺BNAH、1-(2-氨甲酰甲基)-1,4-二氢烟酰胺AmNAH）的稳定性。通过气相色谱（GC）分析底物转化率、产物对映体过量值（ee）与非对映体过量值（de）。放大反应在控温与pH在线调控下进行，产物经有机溶剂萃取后计算环境因子（E-factor）。此外，开发基于预饱和PURGE脉冲序列的原位¹H NMR监测方法，实时追踪反应进程。
结果与讨论
酶生产与表征
研究人员按已报道方法在1 L及15 L规模重组生产TsOYE，经热纯化（70 ℃，90分钟）及FMN过夜孵育后，获得2.4 g纯酶。活性测定显示TsOYE最适温度为65 ℃，最适pH为8.0，与文献报道一致。
助溶剂与缓冲体系优化
在10–200 mM (R)-香芹酮反应中，20% (v/v)二甲基亚砜（DMSO）可显著提升酶活性，尺寸排阻色谱证实DMSO不改变酶的寡聚状态，推测其促进底物与产物溶解。200 mM MOPS缓冲液在40 ℃下可将50 mM底物的1小时转化率从48%（50 mM缓冲液）提升至86%，产物de >99%。但高盐浓度可能抑制酶活性，需权衡缓冲强度。
辅因子比较
以200 mM (R)-香芹酮为底物，合成辅因子BNAH的转化率达66%，优于AmNAH（50%）及GDH/NADPH再生体系（29%）。BNAH反应体系终pH约为9，而GDH体系因葡萄糖酸生成导致酸化，即使在高浓度缓冲下仍限制反应效率。
酶负载量与底物浓度效应
在200 mM底物下，2 μM TsOYE（0.03 wt %）使用BNAH可实现88,895 TON与89%转化率。产物生成量在120 mM处达到平台，分批补加BNAH可突破限制，72小时内达400 mM产物。无DMSO时转化率显著降低。
辅因子稳定性
在Tris、MOPS及磷酸钾（KPi）缓冲液中，NADH稳定性最高，AmNAH次之，BNAH与NADPH最不稳定。酸性条件与磷酸盐显著加速辅因子分解，推荐使用Tris缓冲液（pH 7）以维持辅因子稳定性。
多克级放大
在100 mL体积中，1 M (R)-香芹酮经GDH/NADPH体系催化72小时，转化率达98%，TON为115,765。最优结果来自(S)-香芹酮的50 mL放大反应：使用0.2 wt % TsOYE、GDH/NADPH再生体系，40 ℃下控pH 8.0，72小时后转化率达98%，TON高达123,000，分离得到6.9 g (2R,5S)-二氢香芹酮，产率90%，ee >99%。该反应环境因子为11.6，废水与碱液为主要废物来源，未使用有毒金属，产品纯度约98%。
原位NMR监测
研究人员优化¹H NMR脉冲程序与水峰压制方法，成功实现对50 mM (R)-香芹酮及环己烯酮还原的实时监测。光谱中底物β-碳质子峰（~6.95 ppm）逐渐降低，产物α-碳甲基质子峰（~0.90 ppm）逐渐升高，未检测到中间体。该方法适用于机制研究与敏感反应（如C–C键形成）的无氧监测。
结论
本研究证明耐热TsOYE可实现150 g/L单萜的不对称烯烃还原，以0.2 wt %酶负载量达到123,000 TON，产物ee >99%，环境因子为11.6。相比其他OYE，TsOYE具备进一步放大的潜力。OYE可与其他酶串联，用于合成手性醇、胺等官能团化产物，且在有机溶剂中表现良好，适用于水敏性底物。原位NMR监测技术为深入理解反应机制提供了新工具。该研究突破了OYE工业应用的TON瓶颈，为绿色生物制造提供了高效、可持续的解决方案。
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