猪流行性腹泻病毒（PEDV）持续对全球养猪业构成威胁，可导致致死性新生仔猪腹泻，死亡率接近100%。目前，尚无获批的有效靶向药物。冠状病毒主蛋白酶（Mpro）是一种高度保守且对病毒复制必不可少的酶，因此是抗病毒药物开发中极具前景的靶点。研究人员通过酶学抑制实验表明，氯沙坦这一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的兽药可作为一种高效的泛冠状病毒Mpro抑制剂。此外，氯沙坦可在Vero-E6和IPEC-J2细胞中强效抑制PEDV复制，其半数有效浓度（EC50）分别为1.49 ± 0.38 μM和4.32 ± 0.53 μM，且细胞毒性极低。值得注意的是，氯沙坦可诱导干扰素（IFNs）分泌，并通过STAT1和STAT2的磷酸化激活JAK-STAT信号通路，从而建立双重抗病毒机制。总之，氯沙坦有望成为开发PEDV感染靶向治疗药物的潜在先导化合物。
该研究发表于《Virology》，聚焦于猪流行性腹泻病毒（PEDV）靶向治疗药物匮乏这一现实难题，围绕已获批兽药氯沙坦（Closantel）的抗PEDV潜力及其分子机制展开系统研究。PEDV属于α冠状病毒（Alphacoronavirus），是全球养猪业的重要病原体之一，尤其对新生仔猪危害极大，可引发急性腹泻、呕吐与脱水，死亡率接近100%。尽管疫苗已被应用，但由于PEDV基因变异快、遗传多样性高，其保护效果常常受限，因此开发新的抗病毒治疗策略具有迫切性。冠状病毒主蛋白酶（Mpro，也称3CLpro）在病毒生命周期中负责切割病毒多聚蛋白，是病毒复制不可或缺的半胱氨酸蛋白酶；同时，该酶在不同冠状病毒间高度保守，且与人源蛋白酶差异明显，因此被认为是适合开发广谱抗冠状病毒药物的重要靶点。研究人员基于药物再利用（drug repurposing）思路，对FDA批准药物进行筛选，旨在快速发现可进入临床转化的候选化合物。
在研究设计上，研究人员首先通过重组蛋白表达与纯化建立SARS-CoV-2和PEDV的Mpro体外酶学评价体系，并对121种已上市药物及临床候选药物进行酶学筛选；随后结合分子对接、分子动力学模拟、qRT-PCR、免疫荧光和Western blot等方法，在Vero-E6、IPEC-J2及HEK-293T细胞中评估氯沙坦的抗病毒活性、细胞毒性及宿主免疫调控效应。其中样本来源主要为细胞模型，包括非洲绿猴肾来源Vero-E6细胞、猪小肠上皮IPEC-J2细胞和HEK-293T细胞；病毒株为PEDV CH/SCZG/2017（GⅡb，MH061337）。
3.1. Identification of Closantel as a potent Mpro inhibitor
研究人员首先构建并纯化了SARS-CoV-2 Mpro与PEDV Mpro蛋白，去除GST标签后开展酶学活性检测。在121种药物的初筛中，共有30种化合物在50 μM浓度下对SARS-CoV-2 Mpro表现出超过50%的抑制作用，其中若干抑制率超过70%的候选物进一步进入分析。结果显示，氯沙坦和MG132在10 μM时几乎完全抑制Mpro酶活。进一步剂量反应实验表明，氯沙坦可在低微摩尔浓度范围内剂量依赖性抑制SARS-CoV-2 Mpro，其半数抑制浓度（IC50）为1.23 ± 0.11 μM，抑制常数（Ki）为1.19 ± 0.03 μM。分子对接结果显示，氯沙坦嵌入Mpro催化口袋，并与关键催化残基Cys145和Ser144形成氢键，同时与His41、Met165、Leu167等残基形成Pi-sulfur、Pi-alkyl或烷基相互作用，从而稳定结合于活性位点。基于冠状病毒Mpro催化口袋的保守性，研究人员进一步检测氯沙坦对PEDV Mpro的抑制作用，发现其IC50为1.24 ± 0.24 μM，Ki为0.42 ± 0.01 μM，提示其对PEDV Mpro具有更高亲和力。针对PEDV Mpro的分子对接显示，氯沙坦与His162、Glu165、His41和Cys144等关键残基形成稳定相互作用；100 ns分子动力学模拟进一步表明，氯沙坦在PEDV Mpro口袋中维持稳定构象。研究还通过对接分析提示，氯沙坦可能与SARS-CoV、MERS、TGEV和PDCoV等多种冠状病毒的Mpro活性位点结合，因此具有作为广谱冠状病毒Mpro抑制剂的潜力。
3.2. Closantel restricts PEDV replication in the cell-based assay
在明确氯沙坦具有体外酶抑制活性后，研究人员进一步评估其细胞水平抗病毒效应。在Vero-E6细胞感染模型中，氯沙坦显著且剂量依赖性降低PEDV N基因扩增水平，EC50为1.49 ± 0.38 μM。免疫荧光结果进一步证实，氯沙坦明显抑制PEDV N蛋白表达，说明该药物在细胞内可有效阻断PEDV复制过程。由于PEDV天然嗜性组织为猪肠道上皮，研究人员又在猪小肠上皮细胞IPEC-J2中建立感染模型。结果表明，氯沙坦同样能够显著抑制PEDV N基因表达及病毒复制，EC50为4.32 ± 0.53 μM。细胞毒性分析显示，其在Vero-E6和IPEC-J2细胞中的半数细胞毒浓度（CC50）分别为36.88 ± 4.50 μM和19.93 ± 3.95 μM，相应选择指数（SI）分别为24.75和4.61，表明其在有效抗病毒浓度范围内具有较低毒性。该部分结果说明，氯沙坦不仅在酶学水平靶向抑制Mpro，而且可在细胞水平有效限制PEDV复制。
3.3. Closantel upregulates the antiviral response mediated by interferon
鉴于干扰素（IFNs）系统是宿主先天抗病毒免疫的核心组成部分，研究人员进一步考察氯沙坦是否还能通过增强宿主抗病毒反应发挥作用。在PEDV感染的IPEC-J2细胞中，尽管氯沙坦已抑制病毒复制，但其仍可浓度依赖性上调多种干扰素刺激基因（ISGs），包括IFIT1、IFITM1和ISG15，以及IFN-α、IFN-β和IFN-γ的表达。这提示氯沙坦不仅直接作用于病毒靶点，还可能正向调节IFN介导的抗病毒免疫。为探究其上游机制，研究人员在HEK-293T细胞中给予氯沙坦处理24 h，并采用Western blot检测信号通路分子活化状态。结果显示，氯沙坦可剂量依赖性增强STING和IRF3的磷酸化，同时激活下游STAT1和STAT2的磷酸化，表明其可启动经典STING-IRF3-IFNs-STATs抗病毒先天免疫轴。qRT-PCR进一步证实，在无病毒感染条件下，氯沙坦亦可诱导IPEC-J2细胞中ISGs、IFN-α和IFN-β表达，而对IL-6和TNF-α表达无明显促进作用，说明其免疫激活效应偏向抗病毒干扰素通路，而非广泛炎症因子释放。综合来看，氯沙坦表现出“双机制”抗病毒特征：一方面通过抑制冠状病毒主蛋白酶阻断病毒复制，另一方面通过激活宿主IFN先天免疫反应增强抗病毒效应。
讨论部分指出，药物再利用是应对COVID-19、PED等流行性疾病时极具效率的研发路径，尤其适用于已有安全性和生物利用度信息的已批准药物。该研究将氯沙坦这一卤代水杨苯胺类驱虫药重新定位为抗冠状病毒候选药物，证明其既能直接靶向Mpro，又能增强经典抗病毒先天免疫通路。文中还提到，氯沙坦已知具有较强脂溶性，并在寄生虫中可作用于线粒体内膜、破坏氧化磷酸化过程。作者据此讨论了其可能通过影响线粒体完整性，促进线粒体DNA（mtDNA）异常释放并激活cGAS-STING相关通路的可能性，但这一部分在本文中主要作为机制讨论提出，并非已被本研究直接实验证实的结论。另一方面，PEDV主要感染肠上皮细胞，而氯沙坦作为兽医常用广谱驱虫药，具备一定转化优势，包括已知的安全边际、既有给药经验和生产基础，这使其在养猪业中作为抗PEDV候选药物具有现实意义。研究还提及分子对接结果显示氯沙坦与另一冠状病毒蛋白酶PLpro的催化口袋也具有较好空间匹配，但其是否具有PLpro抑制活性仍有待后续验证。
研究结论部分可译为：药物再利用和对FDA批准药物进行高通量筛选，是开发针对COVID-19和PED等广泛流行疾病治疗药物的有前景策略。本研究通过对121种已上市药物开展高通量酶学筛选，鉴定出氯沙坦是一种强效的广谱冠状病毒主蛋白酶抑制剂。氯沙坦对SARS-CoV-2和PEDV Mpro的抑制常数（Ki）分别为1.19 ± 0.03 μM和0.42 ± 0.01 μM。此外，氯沙坦可在Vero-E6和IPEC-J2细胞中有效抑制PEDV复制，其EC50分别为1.49 ± 0.38 μM和4.32 ± 0.53 μM，并保持良好的安全性。值得注意的是，氯沙坦还能上调经典抗病毒先天免疫IRF3-IFNs-STATs信号通路，从而进一步增强其抗病毒活性。鉴于目前PED尚缺乏有效靶向治疗手段，作为一种在兽医实践中广泛使用的广谱抗寄生虫药物，氯沙坦有望成为治疗PED的新型候选药物。
总体而言，该研究通过“酶学筛选—结构模拟—细胞验证—机制分析”的完整证据链，证明氯沙坦对PEDV具有明确的体外抑制作用，并揭示其同时具备病毒靶向抑制与宿主免疫增强两种抗病毒机制。论文的主要学术价值在于：其一，确认了Mpro作为PEDV抗病毒开发靶点的可行性；其二，为已批准兽药氯沙坦开辟了新的抗病毒适应证；其三，为开发兼具直接抗病毒和宿主免疫调控效应的PEDV治疗策略提供了实验依据。
