一种用于多菌灵检测的先进分子印迹聚合物基电化学适配体传感器

本研究报道了一种集分子印迹聚合物（MIP）和适配体（aptamer）于一体的双识别电化学适配体传感器（MIPEA），用于常见农药多菌灵（carbendazim, CBZ）的检测。与仅基于MIP或适配体的传统传感器不同，该策略通过协同结合适配体的高靶标特异性与分子印迹技术提供的结构相似性和稳定性，增强了分析性能。研究人员在玻碳电极（glassy carbon electrode, GCE）上电沉积铂纳米颗粒（platinum nanoparticles, Pt NPs）和氧化石墨烯（graphene oxide, GO）以形成高导电平台（Pt-rGO/GCE），用于固定CBZ特异性适配体。随后，通过电聚合亚甲基蓝（methylene blue, MB）生成有效的印迹聚合物层。去除CBZ模板后，形成的印迹空腔在尺寸和形状上与CBZ分子互补。当CBZ重新结合到这些印迹位点时，其非导电特性阻碍了氧化还原探针K₄[Fe(CN)₆]在电极表面的电子转移，导致可测量的电流降低。所开发的传感器对CBZ表现出0.4 nM至20 nM的线性响应，检测限（limit of detection, LOD）为1.3 nM。与结构类似的化合物相比，该传感器对CBZ表现出优异的选择性，为未来的CBZ监测应用建立了可靠的平台。

**研究背景与问题**

广谱苯并咪唑类杀菌剂多菌灵（carbendazim, CBZ）在现代农业中应用广泛。CBZ进入食物链后对人类和动物具有危害性，因此建立其残留最大限量标准至关重要。例如，美国和澳大利亚禁止使用CBZ，而欧盟/英国、中国和日本对苹果中CBZ的允许残留量分别为0.2 mg/kg、5 mg/kg和3 mg/kg。因此，监测CBZ残留对于保障人类健康极为关键。传统的CBZ检测技术，如气相色谱法和高效液相色谱法，虽然选择性高、灵敏度好，但存在耗时长、设备昂贵、样品前处理复杂等缺点。基于纳米材料和适配体的电化学传感器因其特异性高、灵敏度高、信号易观测和操作简便等优势，成为更有前景的替代方案。近年来，分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers, MIPs）作为一种新型合成受体，被用于提高电化学适配体传感器的选择性。然而，现有的CBZ电化学传感器在复杂基质环境中通常依赖单一识别受体（仅为MIP或仅为适配体），其选择性受限。仅依赖适配体时，其稳定性易受环境因素和周围生物分子干扰的影响，在复杂基质中可能表现出较差的稳定性和选择性。仅使用MIP时，模板的洗脱过程可能削弱MIP结构并降低靶标结合效率；此外，基于尺寸和形状的识别可能导致非特异性吸附，产生持续夹杂现象。为了克服MIP和适配体单独应用的功能局限，研究人员提出了一种集成两种材料以实现内在亲和力的检测方法。随后，结合MIP和适配体的电化学适配体传感器（MIP-based electrochemical aptasensors, MIPEAs）因其高灵敏度、稳定性、低检测限和优异的检测结果，在食品安全、药物分析和环境监测等领域受到关注。在前期研究中，研究人员已通过一步电沉积法开发了基于铂纳米颗粒（Pt NPs）-还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide, rGO）的CBZ电化学传感器，并通过引入CBZ特异性适配体进一步提高了其选择性。本研究进一步引入了MIP和适配体这两种双识别元素，构建了用于选择性CBZ检测的组合传感平台。

**研究方法与关键技术**

研究人员采用了几种关键技术来构建和表征该双识别传感器。首先，通过电沉积技术在玻碳电极（GCE）表面制备了铂纳米颗粒/还原氧化石墨烯（Pt-rGO/GCE）纳米复合材料，以提供高导电基底。其次，通过Pt─S键将CBZ特异性适配体（Apt）与CBZ形成的复合物（Apt-CBZ complex）固定在Pt-rGO/GCE表面。随后，使用循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）在Apt-CBZ复合物修饰的电极表面电聚合亚甲基蓝（MB）单体，形成分子印迹聚合物（MIP）层。通过含有乙酸和十二烷基硫酸钠的洗涤缓冲液洗脱模板CBZ分子，形成与CBZ结构互补的印迹空腔。电化学表征方法包括循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy, EIS）和差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry, DPV）。同时，使用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）对电极修饰过程进行了形貌和化学结构表征。实际样品检测使用了脱脂牛奶和自来水样本（样本队列来源于本地超市和市政供水）。

**研究结果**

**PMB聚合与MIPEA的表征**
在Pt-rGO/GCE上固定Apt-CBZ复合物后，电聚合MB生成聚亚甲基蓝（PMB）层，随后洗脱CBZ模板。CV曲线在电聚合过程中观察到两个明显的氧化峰，表明MB的有效沉积和PMB膜的形成。FTIR分析证实了各阶段电极表面的化学键合：Pt-rGO显示O─H和C─O等基团；Apt-CBZ复合物-Pt-rGO显示了来自适配体的S-H伸缩振动（2596 cm^-1）和N─H弯曲振动（1550 cm^-1），表明适配体通过Pt─S键成功固定；MIP-Apt-CBZ复合物-Pt-rGO显示了MB的特征峰（如C─N伸缩振动，1203和1142 cm^-1）；洗脱CBZ后，光谱在1750-1450 cm^-1区域的特征峰消失，证实了CBZ的成功洗脱。SEM图像显示，rGO表面均匀分布着平均尺寸为49 nm的花椰菜状Pt NPs，聚合MB后可观察到明显的薄膜层。

**修饰电极的电化学研究**
CV和EIS用于研究电极各修饰阶段的电化学性能。从裸GCE到Pt-rGO/GCE，电流响应增强且电荷转移电阻（R_ct）显著降低，表明导电性和表面积增加。固定Apt-CBZ复合物后，电流略微下降，R_ct升高。形成MIP层后，电流大幅降低，R_ct进一步升高，表明聚合物膜阻碍了氧化还原探针[Fe(CN)₆]^4-的电子传递。洗脱CBZ后，电流部分恢复，R_ct下降，表明印迹空腔的形成增加了表面孔隙率。当CBZ重新结合到印迹位点时，电流再次降低，R_ct显著升高，验证了传感器的响应机制。通过比较MIPEA、仅MIP（MIPE）和无印迹位点的适配体传感器（NIPEA）对CBZ的电流响应变化（ΔI），发现MIPEA的ΔI最大，证实了双识别位点带来的协同增效优势。

**MIPEA实验条件的优化**
研究人员优化了影响CBZ检测性能的关键参数，包括适配体与CBZ的摩尔比、CBZ重结合时间、MB浓度、聚合循环数和聚合溶液的pH值。最佳适配体:CBZ摩尔比为1:1，以确保复合物的最佳形成。CBZ的最佳重结合时间为20分钟，此时结合达到饱和。MB的最佳浓度为0.1 mM，能形成稳定且具有足够印迹位点的聚合物膜。最佳聚合循环数为20次，以平衡膜厚度与识别位点的可及性。聚合溶液的最佳pH值为7.5，此环境下MIP膜稳定性及CBZ结合效率最高。

**MIPEA检测CBZ的分析性能**
在最佳条件下，MIPEA对CBZ表现出0.4 nM至20 nM的线性响应，线性方程为ΔI (µA) = 0.3362 C (nM) + 1.8491 (R² = 0.9848)，检测限为1.3 nM。与文献中其他MIPEA检测CBZ或其他农药的方法相比，该传感器具有可比的检测范围和检测限。

**MIPEA的选择性、重复性、重现性和稳定性**
选择性测试表明，与结构类似的化合物相比，MIPEA对CBZ显示出最强的电流响应，表明其印迹空腔和适配体结合位点提供了优异的特异性识别能力。重复性测试显示，对同一样品连续五次测量的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）为4.2%。重现性测试显示，三个独立制备的传感器测量结果的RSD为1.7%。稳定性测试表明，传感器在4°C储存21天后，对CBZ的响应电流仍保持初始值的93.3%。

**CBZ回收率测试**
将该MIPEA应用于脱脂牛奶和自来水样品中的CBZ检测。在4:1的缓冲液与样品混合基质中，CBZ的平均回收率分别为100%和98%，相应的RSD分别为1.5%和1.7%。结果表明该传感器在实际样品检测中具有良好的准确性和实用性。

**总结讨论与结论**
综上所述，本研究成功开发了一种集适配体和分子印迹聚合物（MIP）双识别功能于一体的电化学适配体传感器（MIPEA），用于高选择性和便捷地检测多菌灵（CBZ）。双识别机制通过在Pt-rGO/GCE上固定Apt-CBZ复合物并随后电聚合MB来实现。洗脱CBZ构建了双识别印迹空腔。CBZ重新结合到MIP-Apt-Pt-rGO/GCE上时，传感器电导率降低，阻碍了电子从K₄[Fe(CN)₆]向电极表面的转移。Pt和rGO的协同效应增强了电导率和表面积。Apt-CBZ复合物和MIP共价固定在Pt-rGO/GCE表面作为传感界面，提升了选择性。通过FTIR和SEM对MIPEA进行了进一步表征，并使用CV、DPV和EIS进行了电化学评估。由于引入了双识别结合位点，所设计的MIPEA对CBZ的检测表现出优于单一MIPE的选择性和灵敏度。该MIPEA对CBZ的线性检测范围为0.4 nM至20 nM，检测限为1.3 nM。与结构类似的分子相比，该传感器对CBZ表现出更好的选择性。此外，传感器展现了令人满意的重现性、重复性和稳定性。在实际应用测试中，该MIPEA在自来水和脱脂牛奶样品中分别有效回收了98%和100%的CBZ。因此，本研究为合成具有双识别元素的受体及其在快速评估CBZ中的应用提供了一种简便的方法。