AMPK/ULK1通路介导热应激下鸭颗粒细胞线粒体自噬增强并促进类固醇生成

线粒体在能量代谢和类固醇生成中发挥着关键作用。热应激会抑制卵巢颗粒细胞（GCs）的类固醇生成并损害家禽的繁殖性能。我们前期的研究表明，线粒体自噬（mitophagy）可以保护鸭GCs免受急性热暴露的伤害。值得注意的是，大量研究证实，AMP活化蛋白激酶/Unc-51样激酶1（AMPK/ULK1）通路是线粒体自噬的关键调控通路。然而，AMPK如何在热应激下协调线粒体自噬和类固醇生成的机制尚不清楚。本研究旨在阐明AMPK/ULK1轴在热诱导的线粒体自噬和类固醇生成中的作用。研究人员利用鸭热处理模型和体外GC培养模型，结合蛋白质免疫印迹（Western blotting）、靶向代谢组学、siRNA介导的基因敲低以及线粒体功能检测，评估了AMPK/ULK1轴对线粒体自噬和类固醇生成的影响。研究表明，热处理诱导了鸭卵巢组织线粒体功能障碍，激活了AMPK/ULK1通路，触发了线粒体自噬，并抑制了类固醇生成。在体外，GCs在热处理下表现出类似的线粒体损伤和AMPK/ULK1依赖性的线粒体自噬激活。LC-MS/MS分析也证实了热处理GCs中细胞内AMP水平升高。此外，通过5′-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）激活AMPK，能够触发线粒体自噬并通过上调类固醇合成急性调节蛋白（StAR）、细胞色素P450 11A1（CYP11A1）和细胞色素P450 19A1（CYP19A1）的表达，增强热处理下GCs的类固醇生成；而用化合物C（Compound C）抑制AMPK则产生相反的效果。此外，通过siRNA基因敲低AMPK或ULK1，减少了热处理下的线粒体自噬和类固醇生成。综上所述，AMPK/ULK1轴介导热诱导的线粒体自噬并增强GCs的类固醇生成，这使得AMPK成为改善热应激家禽繁殖性能的一个潜在治疗靶点。

热应激是影响畜禽生产的主要环境因素之一。当家禽暴露于高温环境时，会引发一系列生理、行为和免疫反应，直接或间接地损害其繁殖性能。卵巢颗粒细胞（GCs）是卵巢中最大的细胞群体和类固醇激素的主要来源，是重要的卵巢体细胞组分。在禽类中，由GCs层合成的孕酮（P4）被运输到内膜层转化为睾酮（T），随后在外膜层被芳香化为雌二醇（E2）。值得注意的是，层级卵泡的GCs层也能直接合成和分泌E2，以调节卵母细胞成熟和卵泡发育。GCs功能障碍会导致排卵紊乱和卵巢功能障碍。因此，理解GCs响应热暴露的分子机制，对于制定减轻热诱导繁殖损失的策略至关重要。线粒体在能量代谢和类固醇激素生物合成中扮演着核心角色。线粒体自噬是一种选择性自噬过程，通过靶向降解线粒体，实现线粒体组分的循环利用并维持细胞稳态。在缺血、缺氧等应激条件下，细胞通过激活线粒体自噬来增强线粒体质量，从而减少活性氧（ROS）产生，防止线粒体膜通透性转换孔的过度开放，确保细胞在应激条件下的基本能量需求，进而促进细胞存活。我们前期的研究显示，热处理损害了鸭GCs的线粒体功能并诱导了氧化损伤，而由动力相关蛋白1（Drp1）调控的、PTEN诱导的激酶1（PINK1）依赖性线粒体自噬能够保护卵泡GCs免受急性热处理诱导的损伤。然而，在热暴露下激活线粒体自噬的上游信号通路仍不清楚。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是一个能量感受器，它通过AMP、ADP和ATP与其γ亚基上三个位点的竞合结合来感知细胞的能量状态。值得注意的是，AMPK能直接磷酸化Unc-51样激酶1（ULK1）的多个残基（包括Ser317、Ser467、Ser555和Ser637），从而启动自噬体形成和线粒体自噬。AMPK还能诱导线粒体网络中受损线粒体的碎片化，并促进自噬机制向受损线粒体的转位，从而促进线粒体的自噬降解（即线粒体自噬）。有证据表明，药理学激活AMPK/ULK1通路可以促进线粒体自噬，增强产热能力，并提高羔羊存活率。虽然线粒体是类固醇生成无可争议的核心细胞器，但AMPK调控的线粒体自噬对这一关键细胞功能的具体影响仍有待阐明。在本研究中，利用鸭热处理模型和体外GC培养模型，研究人员评估了热处理对线粒体功能、AMPK/ULK1通路、线粒体自噬和类固醇生成的影响。进一步地，通过5′-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）和化合物C处理，结合靶向代谢组学，明确了AMPK在调控线粒体自噬和类固醇生成中的作用。此外，siRNA敲低实验证实了AMPK/ULK1在热处理诱导的线粒体自噬和类固醇生成中的关键功能。这些发现为通过饮食或药理学激活靶向AMPK/ULK1来改善热暴露家禽的繁殖性能提供了机制基础。研究使用了60只雌性山麻鸭（Shan Ma ducks）作为体内模型，并从150日龄雌性山麻鸭的F1-F3级卵泡中分离GCs进行体外实验。

本研究首先探究了热处理对鸭卵巢组织及体外培养GCs的影响。在体内模型中，研究人员将鸭暴露于39°C环境0、30、60分钟。结果发现，热处理诱导了卵巢GCs线粒体超微结构损伤（如肿胀、嵴减少），激活了AMPK（Thr183位点磷酸化）和ULK1（Ser556位点磷酸化），增强了线粒体自噬标志物（LC3-II/LC3-I比值、PINK1、Parkin表达增加；Tom20表达降低），并抑制了类固醇合成关键蛋白（StAR, 3β-HSD, CYP11A1, CYP19A1）的表达和血清雌二醇（E2）含量。在体外模型中，将GCs在43°C下热处理1-4小时，观察到线粒体活性氧（mtROS）水平升高，线粒体呼吸链复合物I、II、IV、V活性受抑，ATP水平及Na+/K+-ATP酶和总ATP酶活性下降。同时，热处理也激活了AMPK/ULK1通路并增强了线粒体自噬。靶向代谢组学分析显示，热处理扰乱了GCs的能量代谢，表现为糖酵解相关酶（如PFKFB1、PKM2、LDHA）蛋白表达上调，以及多种糖酵解中间产物（如葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等）水平显著下降，而AMP水平有上升趋势，表明热应激下细胞能量代谢受损并可能转向糖酵解以补偿能量缺口。

随后，研究人员通过药理学干预手段探究了AMPK的调控作用。使用AMPK激活剂AICAR处理，显著增强了热处理下GCs的线粒体自噬（AMPK和ULK1磷酸化增强，LC3-II/LC3-I比值升高，PINK1/Parkin表达上调，Tom20和p62水平下降），并上调了StAR、CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD的蛋白表达，从而改善了类固醇生成。相反，使用AMPK抑制剂化合物C处理，则抑制了热处理下GCs的线粒体自噬，并进一步下调了上述类固醇合成酶的蛋白表达。

为了从遗传学角度验证AMPK/ULK1轴的核心功能，研究人员利用siRNA敲低了GCs中的AMPK或ULK1基因。结果显示，敲低AMPK或ULK1均显著降低了热处理下GCs的线粒体自噬水平（LC3-II/LC3-I比值、PINK1和Parkin表达降低，p62和Tom20水平升高），并进一步抑制了StAR、CYP11A1和CYP19A1的表达以及细胞培养上清中E2的含量。这些遗传干预实验确证了AMPK/ULK1轴对于维持热处理下GCs的线粒体自噬和类固醇生成至关重要。

论文讨论部分指出，热应激通过损害线粒体呼吸链功能、诱导线粒体功能障碍和能量代谢紊乱（ATP合成减少、糖酵解代偿性增强），进而激活AMPK/ULK1信号轴。AMPK作为能量感受器，在感知到能量亏缺（ATP下降，AMP/ATP比值升高）后被激活，并通过磷酸化ULK1启动线粒体自噬，清除受损线粒体，以维持细胞能量稳态和存活。这一保护性的线粒体自噬过程，被证实能够缓解热应激对GCs类固醇生成能力的抑制作用。具体而言，激活AMPK/ULK1介导的线粒体自噬有助于恢复线粒体功能，从而支持需要线粒体参与的类固醇合成过程（如StAR蛋白介导的胆固醇转运）。研究结果与前人关于线粒体质量控制在维持细胞功能（包括生殖细胞功能）中的保护性作用一致。因此，AMPK被视为一个有前景的营养或药理学干预靶点，通过膳食补充AMPK激活剂（如二甲双胍或某些植物提取物）或开发靶向AMPK的药物，可能为增强热暴露家禽的类固醇生成和保护卵巢功能提供实用有效的策略。

论文结论部分明确指出：综上所述，AMPK/ULK1通路介导了热诱导的鸭GCs线粒体自噬和类固醇生成过程。激活AMPK能够增强线粒体自噬并恢复类固醇生成，而抑制AMPK则产生相反的效果。这些发现将AMPK确定为改善热暴露家禽繁殖性能的一个潜在靶点，该效应可通过饮食或药理学激活来实现。