背景：脑小血管病（Cerebral small vessel disease, CSVD）是血管性认知障碍的主要原因，但其早期阶段的改变仍不明确。本研究旨在探讨临床前CSVD模型中行为缺陷、海马微观结构和组织病理学改变之间的关系。方法：研究人员在8周、14周和42周龄时，对易卒中自发性高血压大鼠（Stroke-prone spontaneously hypertensive rats, SHRSP）和Wistar Kyoto（WKY）对照组进行了评估。行为学评估包括开放场实验（Open field test, OFT）、新物体识别（Novel object recognition, NOR）和莫里斯水迷宫（Morris’s water maze, MWM）。脑部磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）采用3.0 T系统配合弥散张量成像（Diffusion tensor imaging, DTI），随后对海马进行了感兴趣区（Region-of-interest, ROI）分析。组织学评估包括苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin, H&E）和尼氏（Nissl）染色。结果：SHRSP表现出与年龄相关的行为学改变，包括运动活动减少（品系×年龄交互作用：p = 0.013），早期识别记忆保留但在42周时下降，以及空间学习能力受损，老年动物的学习改善缺失。值得注意的是，在整个实验时间点，海马的DTI指标保持不变，品系或年龄对各向异性分数（Fractional anisotropy, FA）、平均扩散率（Mean diffusivity, MD）、轴向扩散率（Axial diffusivity, AD）或径向扩散率（Radial diffusivity, RD）均无显著影响（所有p > 0.25）。全脑分析同样未发现显著结果。组织学上，扩大的血管周围间隙（enlarged perivascular spaces, ePVS）被持续观察到，而微出血和含铁血黄素沉积则未见。海马厚度（CA1、CA3、齿状回）得以保留；然而，在老龄SHRSP（42周）的CA3亚区检测到了选择性神经元丢失。结论：尽管未检测到海马微观结构改变（使用常规DTI指标），仍观察到行为衰退，这表明功能损害可能在常规影像学框架的敏感度限制内、结构异常变得明显之前就已出现。这些发现提示，早期CSVD涉及标准影像学无法捕捉的细微细胞和血管功能障碍，强调了需要更敏感的、基于网络和分子层面的研究方法。
脑小血管病（Cerebral small vessel disease, CSVD）是卒中和血管性认知障碍的主要原因，但其早期病理发生机制仍不明确[1]。临床研究传统上依赖白质高信号（White matter hyperintensities, WMHs）、腔隙和微出血等显著的神经影像学特征，但这些标志物代表的是疾病相对晚期的阶段[2]， [3]。越来越多的证据表明，CSVD本质上是一种脑微血管疾病，其特征是进行性的结构改变，包括小动脉硬化、血管壁增厚、管腔狭窄、纤维素样变性和血管周围间隙扩大[3]， [4]。这些血管改变在放射学可检测的病变出现之前很久就已损害脑灌注并破坏组织稳态[5]，因此亟需能够在受控条件下研究早期疾病的实验模型。临床前模型已成为剖析CSVD时间演进不可或缺的工具。其中，易卒中自发性高血压大鼠（Stroke-prone spontaneously hypertensive rats, SHRSP）被广泛认为是最稳健的模型之一，因为它再现了人类CSVD的关键特征，包括慢性高血压引起的血管重塑、内皮损伤、血脑屏障（Blood-brain barrier, BBB）破坏和进行性微血管稀疏[6]， [7]。在此模型中，持续观察到诸如血管壁增厚、管腔直径减小、微出血形成和含铁血黄素沉积等结构改变[8]， [9]。相比之下，Wistar Kyoto（WKY）大鼠作为血压正常的对照组，为分离疾病特异性的血管和实质改变提供了关键的比较框架。重要的是，SHRSP模型能够在明显的卒中或广泛白质损伤之前研究早期血管病理，为CSVD进展的初始阶段提供了独特的窗口期。尽管存在此类模型，当前临床前文献的一个主要局限是对CSVD相关结果的评估是碎片化的。行为学研究常报告运动活动、探索行为和记忆方面的损害；然而，这些发现往往被孤立地解释，而没有与潜在的血管和结构改变直接关联。同样，组织病理学研究证明了血管重塑、血管周围间隙扩大、微出血和神经元丢失，但许多研究缺乏对易损脑结构（如海马）内特定区域的量化[10]。鉴于海马亚区（如Cornu ammonis 1, CA1，CA3，和齿状回（dentate gyrus, DG））在功能和对低灌注及血管功能不全易感性方面的异质性，这一点尤为重要[11]。与此同时，神经影像学方法在CSVD临床前研究中仍利用不足，特别是在将微血管病理与组织水平的微观结构破坏和功能结果联系起来方面。弥散张量成像（Diffusion tensor imaging, DTI）已成为检测组织早期改变的敏感手段，提供了反映轴突完整性、细胞密度和细胞外空间变化的定量指标，如各向异性分数（Fractional anisotropy, FA）和扩散率指数[12]。在CSVD背景下，这些改变可能继发于慢性低灌注、血管硬度增加和间质液动力学受损[13]。当应用于海马感兴趣区（Region of interest, ROI）时，DTI纤维束成像有可能捕捉到血管功能障碍导致的早期微观结构后果，而这些是常规影像学无法检测的。然而，很少有研究在同一实验框架内系统地整合DTI衍生指标、详细的血管组织病理学和行为学评估[14]， [15]。此外，海马是研究早期CSVD相关功能障碍的关键枢纽，因其高代谢需求和对微血管损害的易感性[16]。血管结构改变，包括毛细血管密度降低、血管壁增厚和血管周围间隙扩张，可能扰乱氧气和营养物质输送，导致神经元损伤和突触功能障碍[16]。即使在没有明显病变的情况下，这些过程也可能表现为空间学习、记忆巩固和探索行为的细微损害[17]。因此，需要一种全面的、多模态的方法来阐明血管病理如何驱动微观结构脑改变及后续的认知缺陷。在此背景下，本研究利用SHRSP和WKY大鼠模型，通过一个整合的临床前框架研究早期CSVD。行为学评估，包括新物体识别（Novel object recognition, NOR）和莫里斯水迷宫（Morris’s water maze, MWM），与使用苏木精-伊红（Hematoxylin & eosin, H&E）和尼氏（Nissl）染色进行的血管和海马结构变化的详细组织学评估，以及海马DTI纤维束成像相结合。通过检查这些领域的与年龄相关的变化，本研究旨在建立血管重塑、神经元完整性、微观结构破坏和行为功能障碍之间的机制联系，从而更全面地理解早期CSVD进展。所有实验程序均遵守马来西亚普特拉大学（Universiti Putra Malaysia, UPM）机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）的指南，并获得协议号UPM/IACUC/AUP-R004/2021的批准。样本量估计在实验前使用适合双向方差分析（two-way analysis of variance, ANOVA）的参数进行，假设中等效应量（f = 0.25），显著性水平0.05，统计功效80%。基于这些假设，至少需要80只动物。为减少因死亡、实验排除或成像伪影导致的损失，额外增加了20%，最终目标样本量约为100只动物。总共使用100只雄性大鼠（50只SHRSP和50只WKY大鼠），在马来西亚理科大学动物研究与服务中心获得。经过两周的适应期后，动物根据2×3析因设计（品系[SHRSP vs. WKY]和年龄）被随机分配到实验组。年龄变量包括三个实验时间点，用于研究SHRSP模型内的与年龄相关的变化：8周（高血压前期）、14周（已建立的高血压期）和42周（易卒中期）。该设计产生了六个实验组（WKY和SHRSP在8、14和42周），每组约16-17只动物，以确保组间平衡。该析因框架能够评估品系和年龄对所有测量结果的独立效应和交互作用。所有行为学评估均使用标准化规程进行，并由不知晓动物分组的研究人员实施。数据分析使用IBM SPSS统计软件包（版本29.0）进行。连续变量以平均值±标准差表示。使用双向ANOVA评估品系（SHRSP vs. WKY）和年龄（8、14和42周）的主要效应及其交互作用。对于涉及重复测量的行为指标（例如，MWM获取试验），应用双向重复测量ANOVA，其中时间/试验作为被试内因素。当观察到显著的主要效应或交互作用时，进行Bonferroni校正的事后检验进行多重比较。p值小于0.05被认为具有统计学显著性。研究背景部分强调了CSVD早期病理机制不明以及临床前评估碎片化的问题，阐明了在SHRSP和WKY大鼠模型中整合行为学、神经影像学和组织病理学多模态评估以研究早期CSVD时间演进的必要性。方法部分简要概括了使用的关键技术：行为学测试（OFT、NOR、MWM），3.0T MRI扫描（包括DTI采集与分析），以及组织学分析（H&E和Nissl染色）。样本来源为马来西亚理科大学动物研究与服务中心提供的雄性SHRSP和WKY大鼠。研究结果部分基于原文数据进行总结。在验证CSVD模型方面，SHRSP大鼠的收缩压（Systolic blood pressure, SBP）显著高于WKY对照组，证实了高血压表型，但年龄效应和交互作用不显著。体重在品系和年龄间存在显著差异。行为学评估显示，在OFT中，SHRSP大鼠的运动活动随年龄显著减少，而WKY大鼠保持稳定；此外，SHRSP大鼠在14周和42周时表现出探索行为模式的改变，中心区域探索相对增加。在NOR测试中，SHRSP大鼠在8周和14周表现出识别记忆保留，但在42周时辨识指数（Discrimination index, DI）和识别指数（Recognition index, RI）下降至接近随机水平，尽管统计学上交互作用不显著。在MWM测试中，8周和14周时两组空间学习能力相似，但在42周时SHRSP大鼠的空间学习能力表现出衰退迹象，获救潜伏期改善不一致，探测试验中在目标象限停留的时间也呈下降趋势。组织病理学发现，所有组均观察到扩大的血管周围间隙（ePVS），血管壁增厚在两组中均存在但无显著差异，未见微出血和含铁血黄素沉积。海马亚区（CA1、CA3、DG）厚度在品系和年龄间无显著差异。然而，尼氏染色显示，在42周龄SHRSP大鼠的CA
3亚区神经元活力显著降低，而CA1和DG无显著变化。全脑和海马的弥散MRI分析显示，FA、MD、AD和RD在所有品系和年龄组间均无显著差异，表明在所研究的时间框架内，宏观结构和常规弥散指标所反映的微观结构完整性得以保持。讨论部分指出，本研究的主要发现是功能损害（行为衰退）与结构指标（常规弥散MRI和宏观海马形态）之间存在明显的时间分离。SHRSP大鼠出现行为缺陷，尤其是在后期阶段，而常规DTI指标和海马整体形态基本保留。轻微的血管改变（如ePVS）和区域特异性神经元易损性（特别是CA
3）为这些缺陷提供了部分基础，但可能无法完全解释功能衰退的程度。这表明，在常规影像学可检测到异常之前，行为损害可能已经出现。常规DTI对早期CSVD中细微的微血管、血管周围或炎症改变不敏感，其阴性结果不能等同于没有病理变化。组织学发现的CA
3选择性神经元丢失与该区域的高代谢需求和微血管脆弱性相符，并与观察到的记忆和学习功能下降相吻合，但其具体机制（如微血管功能障碍、神经血管耦合受损）未被直接验证。研究指出了几个局限性，包括临床3T MRI对小动物的空间分辨率限制、仅使用常规张量模型分析弥散数据、ROI分析局限于海马、组织学方法局限于形态学评估以及横断面设计等。未来需要结合高场强MRI、高级弥散模型、敏感加权成像、全脑网络分析和分子生物学技术进行更深入的研究。结论部分总结为：SHRSP大鼠的年龄相关行为损害可以在使用当前实验框架敏感度限制下的常规弥散MRI指标和宏观海马形态测量未检测到异常的情况下发生。组织病理学分析揭示了细微的血管改变和CA
3亚区选择性神经元易损性，表明早期CSVD的特征是区域性和细胞层面的扰动，而非广泛性退行性变。这些发现强调了行为损害可能在常规结构影像学方法检测到异常之前就已可被发现的可能性，尽管这需要进一步的多模态和机制研究来阐明这种表观差异的生物学基础。这一定位将早期CSVD视为一个临床隐匿但生物学活跃的阶段，在此阶段干预可能仍可行，以避免不可逆的结构损伤发生。
