载药球霰石微球用于药物递送：药物在水溶液和人血清中的释放、溶解动力学及机制

研究人员报道了通过共沉淀法合成了负载化疗药物伊立替康（Irinotecan）的碳酸钙（CaCO₃）球霰石（vaterite）微球。研究实现了与其他药物在多孔球霰石中报道的最佳负载量相当的高药物负载，并且表征证实伊立替康的存在未破坏球霰石特有的球形形态。紫外-可见（UV–vis）光谱证明了药物随时间的释放，后者与光学显微镜溶解数据对比显示，药物释放的时间尺度与球霰石载体的溶解时间尺度相关。为模拟在药物递送背景下的应用，研究人员在人血清和稀释的人血清中研究了未负载球霰石和伊立替康负载球霰石的溶解，揭示了人血清对溶解的抑制作用发生在两个截然不同的血清浓度依赖范围内。此外，伊立替康负载球霰石在两种人类胰腺癌细胞系MiaPaCa-2和Capan-1上进行了体外测试，均展示了治疗效果。

传统癌症治疗，如手术、放疗和化疗，无疑提供了显著的治疗效益；然而，其潜在的缺点——特别是损害健康组织的风险——推动了人们对开发新型、肿瘤特异性和创新治疗方法的广泛兴趣。一个有前景的策略是使用靶向药物递送系统，该系统能够在癌症部位实现药物分子的控制释放，从而增强疗效并减少副作用。^(1,2) 肿瘤微环境具有生化特征，如低pH值和改变的酶活性，以及包括异常血管结构在内的病理学差异。⁽³⁻⁵⁾ 现代药物递送系统，如无机微/纳米颗粒、脂质体和树枝状聚合物，利用这些条件实现更有效和靶向的药物递送。⁽⁶⁻⁸⁾ 这些药物递送系统的其他好处还包括提高治疗剂的动力学溶解度和细胞摄取，保护药物免受恶劣生物环境的影响以延长循环时间，以及共递送治疗和诊断剂以增强疗效并实现实时监测。⁽⁶⁾

近年来，无机材料因其在负载和释放药物的同时保持结构稳定性、提供可调降解速率以及与有机载体相比更高的药物负载能力，已被注意为药物递送系统中的有前景的载体。⁽⁹⁻¹¹⁾ 多孔球霰石因其高度发达的内部结构能够掺入低分子量化合物和大分子，已被广泛用作药物递送系统的载体。^(12,13) 此外，其在酸性条件下的增强溶解支持pH响应性释放机制，从而能够在相对酸性的细胞外微环境（尤其是肿瘤周围的微环境，如本工作所探讨的）中实现靶向药物递送。^(14,15) 近期的工作表明，球霰石可用作“牺牲基质”，通过吸附或共沉淀途径负载生物分子，然后在球霰石表面包覆聚合物壳层并溶解核心。⁽¹⁶⁾ 在其他情况下，核心被保留并与壳层一起使用以增加对外部影响的抵抗力。也有一些系统被提出不需要形成壳层，特别是当打算进行肠胃外给药时，因为这避免了胃部的酸性环境，而球霰石在其中会快速溶解。

球霰石在不同介质中的溶解行为和结构稳定性的基础研究，对于建模和评估其作为药物递送系统的有效性至关重要。最近的研究进展采用光学显微镜研究单个球霰石（以及方解石）颗粒，以及生物矿化的颗石（coccoliths）和颗石藻（coccolithophore）细胞的溶解。^(17−21) 这种方法能够在明确的（“平板上的球体”）扩散质量传输机制内进行研究，从而提取动力学和热力学洞察及参数。研究表明，球状单体和聚集的（纯）球霰石颗粒的溶解都发生在热力学控制下，其速率由溶解度积和溶解固体从溶解界面扩散出去的速率决定。^(17,18,22) 球霰石/羟基磷灰石核-壳颗粒的合成也已被开发，其溶解过程以两个热力学控制阶段进行，分别对应于壳层和核心的溶解。⁽²³⁾ 此外，研究人员还研究了镁吸附对球霰石溶解及其向方解石转化的影响。⁽²⁴⁾

伊立替康（Irinotecan）显示出强烈的抗肿瘤活性，被广泛用于治疗各种癌症，包括胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma）。其相关的副作用，包括骨髓抑制（myelosuppression）和腹泻，构成了其剂量限制性毒性（dose-limiting toxicity），这意味着将其纳入药物递送系统可能对减少健康细胞暴露大有裨益。⁽²⁵⁾ 以前将伊立替康纳入先进的药物递送系统已显示出增加抗肿瘤活性的良好效果。特别是，最近的一项III期临床试验表明，与传统剂型相比，伊立替康的脂质体制剂（liposomal formulation）实现了更低的清除率、更长的半衰期和更强的肿瘤蓄积，支持其改善的治疗特性。^(26,27) 最重要的是，该试验显示了十余年来转移性胰腺导管腺癌最显著的生存改善，凸显了先进药物递送系统增强伊立替康疗效的变革性潜力。⁽²⁷⁾ 在本文报道的工作中，伊立替康被新颖地纳入球霰石中，并展示了其在水溶液条件以及纯和稀释人血清中的溶解行为。此外，伊立替康负载球霰石以及常规伊立替康的抗肿瘤活性在人胰腺癌细胞系MiaPaca-2和Capan-1上进行了测试。

实验部分采用超纯去离子（DI）水（在298 K时电阻率接近18.2 MΩ·cm；pH ≈ 6.7），通过Milli-Q系统获得，除细胞培养和药敏分型研究外，所有实验均使用该水。pH值使用配备HI1131B玻璃可填充探针的Hanna Instruments HI5221 pH计测量。

颗粒合成部分，遵循Milner等人的方法，通过向含有3 mL 1 M CaCl₂·2H₂O和9 mL去离子水的溶液中加入3 mL 1 M Na₂CO₃来合成球形球霰石微颗粒。混合物在650 rpm下搅拌45秒，并在25 °C下保持15分钟。颗粒通过在2500 g下离心1分钟收集，用去离子水洗涤一次，然后悬浮在1–2 mL甲醇中，甲醇在室温下蒸发以获得干燥的球霰石。

伊立替康负载球霰石颗粒使用类似程序合成，保持相同的钙和碳酸根离子浓度及搅拌条件，并加入盐酸伊立替康（irinotecan hydrochloride）并进行轻微修改。将含有5 mM盐酸伊立替康的400 mM CaCl₂·2H₂O溶液（7.5 mL）与含有5 mM盐酸伊立替康的400 mM Na₂CO₃溶液（7.5 mL）混合，随后搅拌45秒，然后静置15分钟不搅拌。离心后，保留上清液用于分析，颗粒通过三个洗涤步骤分离，包括重悬于15 mL水中、离心和分离颗粒。最后，颗粒重悬于小体积（~0.5 mL）水中，并在80 °C烘箱中干燥1小时。

颗粒表征方面，对于扫描电子显微镜（SEM）分析，颗粒沉积在碳胶带上并溅射镀金。成像使用Zeiss Sigma 300场发射扫描电子显微镜（FEG-SEM）在2 kV加速电压下进行。X射线衍射（XRD）图谱使用配备Cu Kα_1,2辐射的Bruker D8 Advance Eco粉末衍射仪获得。在15–60°的2θ范围内收集图谱，步长为0.031°。

药物负载定量方面，使用Shimadzu UV-1800分光光度计通过UV–Vis光谱定量伊立替康负载，包括合成后上清液的间接测量和颗粒在酸中溶解后的直接测量。基于220 nm处吸光度的比尔-朗伯（Beer–Lambert）校准用于将吸光度与质子化伊立替康（作为盐酸盐，伊立替康 HCl）和非质子化伊立替康（由1 mM 伊立替康 HCl + 5 mM Na₂CO₃制备然后稀释至相关条件）的浓度相关联。对合成上清液（100倍稀释）和颗粒溶解后获得的溶液（通过向1 mg mL⁻¹颗粒悬浮液中加入200 μL 1 M HCl然后10倍稀释制备）在200–400 nm范围内记录UV–Vis光谱，以定量药物负载。

去离子水中的颗粒溶解实验部分，使用倒置光学显微镜实时监测单个颗粒的投影面积，如Milner等人所述。^(17,18) 合成的伊立替康负载球霰石颗粒分散在10 mL去离子水（4 μg mL⁻¹）中，并引入观察室，悬浮在显微镜物镜上方。一旦部分颗粒沉降在室底部（~10秒），即开始每10秒间隔的时间推移成像。使用20倍物镜（Olympus UPLXAPO 20x）和LED相差照明（Aura Pro, Cairn Research, Kent, U.K.）进行观察，并使用ORCA-Flash 4.0数码相机（C13440–20CU, Hamamatsu Photonics, Japan）捕获图像，提供16位、4百万像素图像。为研究Fe(II)对纯球霰石颗粒溶解速率的影响，遵循相同程序，将颗粒以4 μg mL⁻¹浓度悬浮在FeSO₄·7H₂O（≥99%, Fisher Scientific）浓度为3、20和80 μM的水溶液中。

药物释放UV–Vis实验部分，为监测伊立替康从伊立替康负载球霰石颗粒中随时间释放，在锥形瓶中制备了颗粒浓度为40 μg mL⁻¹的大体积悬浮液（60 mL），并使用磁力搅拌棒连续搅拌。搅拌开始后立即，使用微量移液器从悬浮液中取等分试样转移至比色皿中，并使用Shimadzu UV-1800分光光度计在200–400 nm范围内采集吸收光谱。此取样程序在0至10分钟内每2分钟重复一次，在10至30分钟内每5分钟重复一次，并在总搅拌时间为40分钟后再重复一次，所有样品取自同一搅拌悬浮液。使用三批独立合成的伊立替康负载球霰石颗粒重复该实验，并在每个时间点对重复样的220 nm处吸光度取平均值。第一个数据点绘制在t = 0.5分钟，以考虑获取初始测量所需的时间。

人血清中的颗粒溶解部分，为使用与水中溶解相同的倒置光学显微镜装置研究人血清中球霰石和伊立替康负载球霰石颗粒的溶解，实验程序略有修改。最初使用颗粒浓度为4 μg mL⁻¹的10 mL悬浮液进行的实验受到人血清的不透明度和粘稠度的阻碍，这降低了图像聚焦度并导致颗粒在观察室表面沉降增加。因此，对于纯人血清和所有人血清–去离子水混合物中的溶解研究，使用浓度降低至1 μg mL⁻¹的5 mL悬浮液。值得注意的是，在5 mL 1 μg mL⁻¹去离子水中测得的溶解速率与在10 mL 4 μg mL⁻¹去离子水中获得的相同。球霰石颗粒的溶解在14种不同条件下进行了研究，包括纯人血清（HS）、纯去离子（DI）水和一系列中间HS/DI水混合物。伊立替康负载球霰石颗粒的溶解在四种条件下进行了研究：纯HS、纯DI水和两种中间混合物。

数据分析部分，光学显微镜图像使用ImageJ（Fiji）分析。颗粒投影面积使用“Default”自动阈值算法获得，并使用校准的像素-距离比从像素计数转换为物理面积。ImageJ也用于SEM图像分析。溶解和XRD测量的数据绘图和拟合使用OriginPro 2023进行。

细胞培养部分，Capan-1在含有20%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养。MiaPaCa-2在含有20% FBS、4 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。解冻后使用支原体检测试剂盒进行支原体检测，以确保细胞无支原体。培养基每2至3天更换一次，当细胞达到80%汇合度时进行传代。传代时，细胞用胰蛋白酶/EDTA孵育5分钟。通过添加含FBS的培养基停止解离。细胞悬液在1200 rpm下离心5分钟。离心后，细胞重悬于细胞培养基中，并以1:5的稀释度铺板。

药敏分型部分，为进行药物测试，细胞用吖啶橙/碘化丙啶（Acridine Orange/Propium Iodide）染色，并使用LUNA自动细胞计数器计数。每孔接种3000个细胞于96孔板中。接种后24小时，药物以三重重复、浓度范围从13 nM到50 μM的系列稀释添加。伊立替康溶解在DMSO中，伊立替康负载球霰石溶解在NaCl中，储备浓度为25 mM。孵育4天后，进行CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒测量细胞活力。发光测量使用VICTOR Nivo多孔板读数仪进行。剂量反应曲线在GraphPad Prism（版本10.6.0）中计算。

研究结果与讨论部分，负载生物分子到多孔球霰石中可采用共沉淀或吸附途径。在共沉淀的情况下，通过球霰石形成的同时掺入，可实现水溶性药物的高负载。相比之下，对于可溶于有机溶剂并与预制球霰石颗粒混合的疏水性药物，更倾向于采用吸附途径。鉴于其良好的水溶性，盐酸伊立替康通过共沉淀途径掺入。使用UV–Vis光谱估计了颗粒中伊立替康的负载，包括从合成后上清液的间接测量和颗粒分离后溶解的直接测量，显示负载量超过100 μmol/g。关于用于估计负载量的方法和数据的更多讨论见支持信息第1节。

为进一步表征伊立替康负载颗粒，进行了XRD和SEM分析。XRD图谱（支持信息第2节）证实球霰石是占绝对主导地位的碳酸钙多晶型。图1展示了伊立替康负载颗粒和使用相同合成但不含伊立替康制备的球霰石颗粒的SEM图像。两种情况下均可清晰看到由纳米级、近似球形亚基组成的球形微颗粒，这是球霰石的特征。对于伊立替康负载球霰石，样品在球霰石颗粒表面显示出非球霰石物质的痕迹。非球霰石颗粒的平均直径为3.0 ± 0.7 μm，而未使用伊立替康制备的球霰石颗粒为3.7 ± 0.6 μm。这表明药物的存在并未显著改变多晶型形成或颗粒生长。非球霰石表面物质可能对应于伊立替康，下文将进一步讨论。支持信息第2节提供了更多讨论和图像，以及部分颗粒聚集的报告，这与后续讨论相关。

使用光学显微镜研究了伊立替康负载球霰石颗粒的溶解行为。(17,18) 基于先前的工作，(17−19) 这种方法允许测量单个颗粒的投影面积，并在明确的扩散质量传输机制控制条件下绘制其随时间溶解的曲线。在既定模型中，这种方法可以区分热力学控制和动力学控制。在热力学控制的情况下，溶解速率由溶解度积和溶解固体的扩散决定，而对于动力学控制，速率完全由界面反应动力学决定。对于碳酸钙溶解的具体情况，这两种限制机制如方程1和2所示，分别对应热力学控制和动力学控制：
CaCO3(s) ⇌kbkf Ca2+(aq) + CO32−(aq) kmt→ bulk (1)
CaCO3(s) →kir Ca2+(aq) + CO32−(aq) (2)
速率常数kf对应于溶解，kb对应于沉淀；kmt是质量传输速率常数，kir是仅界面动力学重要时的溶解速率常数。考虑这些机制以及从光学显微镜装置中提取的数据，可以通过投影面积随时间的线性变化来识别热力学控制，而动力学控制则以直径随时间的线性变化为特征。对于纯球霰石单体颗粒，观察到了热力学控制，证据是颗粒投影面积随时间线性变化，平均溶解速率为(1.1 ± 0.1) × 10−13 m2 s−1。(17,18)

对于伊立替康负载球霰石颗粒的数据集，投影面积随时间线性减小，而直径呈非线性变化（图2），这与热力学控制下的溶解一致，而非动力学控制。对对应于前50%面积减少区域的线性拟合得出平均溶解速率为(1.1 ± 0.1) × 10⁻¹³ m² s⁻¹，与纯球霰石获得的值有效相同。^(17,18) 这允许推断，将伊立替康掺入球霰石中不会影响颗粒的溶解机制或动力学，无论是定性还是定量上。

通过UV–vis光谱监测了伊立替康释放的时间尺度。对应于伊立替康浓度的波长处的吸光度在重复样之间取平均，并绘制为时间的函数（图3）。在初始测量中观察到显著的吸光度，随后逐渐增加，在大约15分钟后达到稳定值。初始高吸光度归因于伊立替康从颗粒外表面和几乎立即的内表面的释放。随后，随着颗粒溶解的进行，暴露出吸附有药物的新鲜内表面，药物被释放。随后随时间观察到的逐渐增加的吸光度，是由于颗粒继续溶解并将伊立替康释放到溶液中。

为了比较伊立替康释放的时间尺度与球霰石溶解，以40 μg mL⁻¹的颗粒浓度重复了光学显微镜实验，显示一组单个（非聚集的）伊立替康负载颗粒完全溶解的平均时间为11 ± 1分钟。所分析颗粒的面积与时间图包含在支持信息第3节中。通过肉眼检查图3可以清楚地看到，伊立替康释放的时间尺度与颗粒溶解相关。为了扩展这种比较，计算了达到不同程度的伊立替康释放或颗粒溶解所需的时间，并在支持信息第4节中进行了讨论。同样，两者明显相关，但伊立替康释放略快于颗粒溶解。这种短时间滞后可能是由于一些伊立替康在颗粒完全溶解前就扩散出了孔隙。

为了量化药物递送背景下的动力学，使用倒置光学显微镜研究了未负载和伊立替康负载球霰石在稀释和未稀释人血清中的溶解。由于人血清的不透明度和粘稠度，需要进行调整；参见支持信息第5节的讨论。在14种不同条件下研究了球霰石颗粒的溶解，包括纯人血清（HS）、纯去离子（DI）水和一系列中间混合物。在四种条件下研究了伊立替康负载球霰石的溶解：纯HS、纯DI水和两种中间混合物。值得注意的是，投影面积随时间的变化表现出良好的线性度，表明无论人血清浓度如何，溶解都在热力学控制下发生；图见支持信息第5节。平均溶解速率通过线性拟合对应于前50%投影面积减少的区域提取，每种条件下至少使用五个颗粒。这些值为球霰石和伊立替康负载球霰石绘制在图4中，作为人血清百分比（%HS，根据去离子水中的血清体积分数计算）的函数。对于球霰石颗粒，当条件从0% HS（纯去离子水）变化到8.3% HS时，平均溶解速率急剧下降了约3倍。随后，溶解速率在高达75% HS的范围内保持相对恒定且与人血清浓度无关，之后在向100% HS（纯人血清）过渡时进一步下降。总体而言，溶解速率降低了约5倍，从纯水中的(9.6 ± 0.5) × 10⁻¹⁴ m² s⁻¹降至纯人血清中的(2.1 ± 0.4) × 10⁻¹⁴ m² s⁻¹。伊立替康负载球霰石颗粒收集的数据（图4）密切反映了这一趋势。

溶解速率的两阶段浓度依赖性表明，仅靠粘度效应不太可能解释所观察到的行为；人血清的相对粘度最高可达1.6。⁽²⁸⁾ 相反，蛋白冠（protein corona）的形成——纳米和微颗粒在暴露于生物流体时被蛋白质和生物分子层包裹——提供了一个更可能（尽管是推测性的）的解释。⁽²⁹⁾ 溶解速率的最初急剧下降可能反映了通过丰富的低亲和力（即弱结合）蛋白质的快速吸附形成软冠（soft corona），随后在较高浓度下，由高亲和力（即强结合）蛋白质形成硬冠（hard corona），进一步抑制溶解。请注意，可能的Fe²⁺吸附作为潜在的速率抑制剂进行了调查，这是受其在人类血清代谢组中的高丰度（总浓度，包括结合的离子，~9 mM）及其在球霰石上强吸附的潜力所启发。⁽³⁰⁾ 然而，根据支持信息第6节概述和讨论的实验，排除了这种可能性。

伊立替康-球霰石的抗肿瘤作用通过对两种已建立的胰腺癌细胞系MiaPaca-2和Capan-1进行体外药物测试得到证实。如Beutel等人之前所述，⁽³¹⁾ 伊立替康和伊立替康-球霰石以10种浓度（从13 nM到50 μM）添加，并在孵育4天后测量细胞活力。图5显示了相应的剂量反应曲线。IC₅₀（表示细胞活力降低50%的药物浓度）用于量化两种药物的抗肿瘤活性。伊立替康在浓度高于0.5 μM时导致细胞活力降低，MiaPaCa-2细胞的IC₅₀值为24.18 μM，Capan-1细胞为3.49 μM。这些IC₅₀值与先前发表的结果相当。^(32−34) 达到等效的细胞活力降低需要更高浓度的伊立替康-球霰石。IC₅₀值分别为MiaPaCa-2的113.90 μM和Capan-1的29.89 μM。这可能是由于伊立替康-球霰石效果降低所致，因为在生理pH下，并非所有伊立替康都可能释放到细胞培养基中。

研究结论部分，除了合成新型的伊立替康负载球霰石颗粒外，这项工作还证明了颗粒溶解与药物释放之间的明确相关性。此处使用的实验方法可以很容易地应用于药物或载体发生改变的其他系统。水中的溶解研究提供了关于系统行为的基础机制和动力学洞察，而将这些研究扩展到人血清则在与体内应用更相关的条件下提供了可比的洞察。在人血清/水混合物中的溶解实验揭示了显著的浓度依赖性，溶解速率在两个不同的范围内降低，初步归因于蛋白冠的形成。最后，伊立替康负载球霰石颗粒被证明在两种人胰腺癌细胞系中发挥治疗作用。这些结果对于未来的临床应用是有前景的。通过实现酸性肿瘤部位的靶向释放，伊立替康负载球霰石有可能减少不良副作用，同时增加其浓度和抗肿瘤活性。由于在体外实验中发现伊立替康比伊立替康-球霰石毒性更强，可以推测在生理pH下进行的体外实验中并非所有伊立替康都被释放。因此，未来将在不同pH范围内进行更广泛的体外研究，以评估球霰石在生物系统中递送的全部潜力。这项工作可以伴随着在模拟不同pH生物环境中的药物负载系统动力学研究；这因人血清等系统的缓冲能力而复杂化。尽管如此，研究结果证明了伊立替康-球霰石作为药物递送系统的可行性，从而支持其未来的临床应用。