华东地区儿童碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（CRE）分离株的流行病学及临床特征

摘要：
引言：碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）是最常见的临床病原体之一。研究儿童分离CRE的抗菌药物耐药性、高毒力（hypervirulence）及临床特征，有助于指导抗感染治疗。

方法：研究人员分离了非重复CRE临床菌株，并采用质谱法（mass spectrometry）对临床分离株进行鉴定。采用VITEK 2 Compact系统和Kirby-Bauer方法分析抗菌药物敏感性。此外，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和测序检测耐药及高毒力相关基因。

结果：本研究共鉴定281株非重复CRE菌株。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，55.87%）、大肠埃希菌（Escherichia coli，36.65%）和产气克雷伯菌（Klebsiella aerogenes，3.20%）为前3位CRE菌种。这些菌株对大多数抗菌药物表现出高度耐药，并携带碳青霉烯酶基因，包括blaOXA-232（38.08%）、blaKPC-2（20.28%）、blaOXA-1（17.08%）、blaNDM-5（10.32%）和blaNDM-1（8.90%）。此外，blaTEM-1（98.93%）、blaCTX-M-14（88.61%）和blaSHV-11（87.54%）是这些菌株中流行的超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）基因，而AmpC头孢菌素酶基因的检出率并不高。此外，45株（28.66%）碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）携带高毒力相关基因iucA（24.84%）、prmpA（17.83%）、peg-344（17.20%）和prmpA2（9.55%）。其中，22株（14.01%）CRKP菌株同时被鉴定为碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae，CR-HVKP）。更为严重的是，感染CR-HVKP的患儿总体预后更差。

结论：本研究揭示了中国华东地区苏州儿童患者CRE菌株的耐药性、高毒力及流行病学特征。遗憾的是，研究还鉴定出可导致更严重感染的CR-HVKP菌株，这应引起临床医师的高度关注。

该论文发表于《Frontiers in Microbiology》，聚焦中国华东地区苏州大学附属儿童医院儿童患者碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）的流行病学、耐药机制、高毒力特征及其临床相关性。研究背景在于，CRE已成为全球公共卫生领域最棘手的革兰阴性病原体之一，可引起呼吸道、泌尿道、血流、消化道、皮肤及脑脊液等多部位感染。由于CRE通常具有广泛耐药甚至泛耐药特征，临床可选治疗手段十分有限，且儿童患者往往预后更差。既往研究表明，中国儿童CRE检出率持续升高，部分地区甚至高于成人。与此同时，高毒力肠杆菌目细菌，尤其高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP），因具备更强侵袭力和致病性，也成为全球关注重点。更值得警惕的是，碳青霉烯类耐药与高毒力两种危险表型可叠加于同一菌株，形成碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-HVKP），这类菌株往往与更重症感染和更差临床结局相关。然而，针对儿童分离株中此类重叠现象的研究仍较有限，因此开展本研究具有明确的临床与公共卫生意义。

研究人员围绕2016年至2020年苏州大学附属儿童医院收集的儿童CRE临床非重复分离株，系统分析菌种构成、年度变化趋势、抗菌药物敏感性、碳青霉烯酶及其他耐药基因谱、高毒力相关基因分布，以及CR-HVKP感染患儿的临床特征。研究显示，5年间共获得281株CRE，主要菌种为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和产气克雷伯菌。总体上，CRE对多数常用抗菌药物呈高度耐药，且普遍携带多种碳青霉烯酶基因和超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因。更重要的是，在CRKP中发现一定比例菌株兼具高毒力相关基因与高黏液表型，证实儿童患者中已存在CR-HVKP，并且此类感染与更长住院时间、较低治疗有效率及较差总体预后相关。研究结论强调，儿童CRE，尤其CR-HVKP，已成为值得临床持续警惕的高风险病原体。

本研究主要采用以下关键技术方法：以苏州大学附属儿童医院2016年1月1日至2020年12月31日期间儿童患者临床非重复CRE分离株为研究队列来源；使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定；采用VITEK 2 Compact系统与Kirby-Bauer（K-B）法开展药敏试验；采用聚合酶链反应（PCR）扩增碳青霉烯酶基因、ESBL基因、AmpC头孢菌素酶基因及高毒力相关基因，并结合测序和BLAST比对进行确认；对携带高毒力基因菌株进一步实施拉丝试验（string test）以判定高黏液表型；最后以WHONET和卡方检验进行统计分析。

在“Epidemiology and clinical characteristics of CRE infection”部分，研究人员首先明确了研究对象的基本流行病学构成。281株CRE中，肺炎克雷伯菌157株，占55.87%；大肠埃希菌103株，占36.65%；产气克雷伯菌9株，占3.20%；其余为阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鸟氨酸拉乌尔菌、黏质沙雷菌、产酸克雷伯菌及Salmonella Ughelli。年度变化显示，CRE菌株数量和分离率在2017年因CRKP和产气克雷伯菌增加而上升，但2018—2020年逐年下降；与此相对，大肠埃希菌相关CRE在2018—2020年略有上升。患儿中位年龄为1个月，90.75%小于5岁，提示婴幼儿是主要受累人群。标本主要来源于尿液和痰液，分别占40.57%和40.21%，其次为血液。患儿主要分布于新生儿科、NICU、血液科和PICU。主要诊断包括肺炎、尿路感染、黄疸和败血症，部分患儿合并心脏病、白血病等基础疾病。整体抗感染治疗后83.63%患儿病情改善，中位住院时间为27天。这部分结果说明，儿童CRE感染具有明显低龄化特征，且与新生儿及重症医疗场景高度相关。

在“Antimicrobial susceptibility”部分，研究人员通过药敏试验揭示了CRE分离株的广泛耐药表型。所有CRE菌株对美罗培南和亚胺培南均耐药，同时对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁、头孢替坦、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林和复方磺胺甲噁唑等也表现出较高耐药率。总体上，相对仍具活性的药物为庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星和环丙沙星。分菌种分析显示，肺炎克雷伯菌除对庆大霉素、妥布霉素和左氧氟沙星相对敏感外，对其他多数药物耐药率均较高；大肠埃希菌则对研究中所有抗菌药物均表现出高耐药性；产气克雷伯菌相对更敏感。该结果提示，儿童CRE的经验性抗感染治疗面临显著挑战，不同菌种之间的耐药谱亦存在差异。

在“Distribution of carbapenem-resistant genes”部分，研究人员通过PCR和测序分析了主要耐药基因构成。结果显示，CRE菌株携带的主要碳青霉烯酶基因为blaOXA-232、blaKPC-2、blaOXA-1、blaNDM-5和blaNDM-1，其中blaOXA-232检出率最高。ESBL相关基因中，blaTEM-1、blaCTX-M-14和blaSHV-11最常见；AmpC头孢菌素酶基因中仅blaDHA-1有一定检出率，其他AmpC基因未见检出。这些基因广泛存在于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、产气克雷伯菌和阴沟肠杆菌中。该部分结果从分子层面解释了CRE对多类β-内酰胺类药物的高耐药现象，也反映出儿童CRE菌株具有复杂的多重耐药基因背景。

在“Distribution of hypervirulence-associated genes and hypervirulent strains”部分，研究重点转向高毒力相关分子标志。157株CRKP中，45株携带高毒力相关基因，分别为iucA、prmpA、peg-344和prmpA2；而crmpA、terB、iroB和irp2未检出。大肠埃希菌相关高毒力基因Stx1、Stx2和eae也均未检出。进一步结合拉丝试验，22株同时具有高毒力基因和高黏液表型的CRKP被界定为CR-HVKP。该结果表明，在儿童临床分离株中，肺炎克雷伯菌是高毒力与碳青霉烯耐药重叠的主要宿主菌种，而大肠埃希菌在本研究中未显示相应高毒力分子特征。

在“Clinical characteristics of CR-HVKP infection”部分，研究人员比较了CR-HVKP与非高毒力CRKP感染患儿的临床差异。时间分布上，CR-HVKP在2018年达到峰值，占全部CR-HVKP的50%，其后下降。临床比较显示，PICU中CR-HVKP感染患儿比例显著高于非高毒力CRKP感染者；CR-HVKP感染患儿发生肺炎的比例也显著更高。与此同时，CR-HVKP感染患儿平均住院时间更长，抗菌治疗有效率更低，且差异具有统计学意义。这些结果支持CR-HVKP具有更强致病潜力，并与更严重临床过程相关。

讨论部分指出，本研究证实了苏州地区儿童CRE的菌群构成、耐药特点及高毒力分布特征。虽然该地区儿童CRE检出率低于国内部分地区，且2018年后总体下降，但CRE仍是儿童特别是低龄患儿中的重要临床威胁。研究发现，与中国成人中常见的blaKPC-2优势不同，儿童患者中blaOXA-232、blaNDM-1和blaNDM-5同样占据重要地位，提示儿童群体耐药基因流行谱具有特殊性。此外，部分表型CRE未检测到相应碳青霉烯酶基因，说明除碳青霉烯酶产生外，外膜孔蛋白功能障碍、AmpC或ESBL高表达、外排泵及青霉素结合蛋白改变等机制亦可能参与耐药形成，但本文未进一步展开机制验证。关于高毒力方面，研究强调CR-HVKP的出现尤应引起重视，因为该类菌株兼具难治性和高致病性，尤其对儿童重症监护病房患者构成更大威胁。作者同时指出，本研究未进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和全基因组分析，因此对菌株传播、克隆进化及毒力-耐药基因共传播机制的解释仍有限。

研究结论可译为：本研究揭示了中国华东地区苏州儿童患者CRE菌株的耐药性、高毒力及流行病学特征。遗憾的是，研究还鉴定出可导致更严重感染的CR-HVKP菌株，这应引起临床医师的高度关注。