月桂（Laurus nobilis L.）是土耳其种植的最具经济和药用价值的芳香植物之一；然而，在一个省份内部，其精油（EO）的产量、化学成分和生物活性在多大程度上受到发育（即物候期）和地理位置因素的共同影响，仍缺乏充分的表征。本研究通过分析从锡诺普省（Sinop）六个区（中心区、阿扬吉克区、埃尔费莱克区、特尔凯利区、迪克门区和盖尔泽区）采集的36份EO样本，旨在填补这一研究空白。样本在连续六个月（2023年10月至2024年3月）内收集。EO通过水蒸气蒸馏获得，并采用气相色谱-质谱/火焰离子化检测器（GC-MS/FID）进行成分表征；抗氧化活性通过1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除法评估；抗菌活性则通过纸片扩散法和微量稀释法对九种微生物菌株进行了评价。EO得率范围为0.5%至1.5% (v/w)。GC-MS分析在每个样本中鉴定出10-22种组分（占总成分的85.7%-98.9%），其中桉叶油醇（eucalyptol）（43.9%-65.5%）、乙酸松油酯（α-terpinyl acetate）（7.7%-15.4%）和桧烯（sabinene）（2.4%-12.6%）为主要成分。地理变异性对六种组分（包括α-蒎烯（α-pinene，p=0.002）、桧烯（p<0.001）和芳樟醇（linalool，p=0.026））具有统计学显著影响。时间变异性则仅限于桉叶油醇（p<0.001）和乙酸松油酯（p=0.017）。DPPH实验得出的半数抑制浓度（IC50）值为119.8–426.8 µL/mL，其中特尔凯利区-十一月样本表现出最强的活性（IC50 = 119.8 µL/mL）；地理位置或整体时间差异均未达到统计学显著性。抗菌实验显示EO具有广谱活性，对芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）表现出最低的最低抑菌浓度（MIC）（320 µg/L）；仅针对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）检测到了显著的地理变异（p<0.01）。总体而言，地理环境被证明是比发育期更为一致的化学成分变异来源，这对优化月桂在制药和食品工业中的采收策略具有实际意义。
月桂（Laurus nobilis L.）是一种非常重要的药用和芳香植物，隶属于樟科（Lauraceae）[1]。该植物的叶片产生的无色至淡黄色精油（EO）具有多种治疗功效[2]。土耳其是月桂的主要生产国，产品出口至64个国家[3]。在1999年至2001年期间，土耳其年均出口干月桂叶约400万公斤[4]。月桂叶EO是一种复杂的挥发性次生代谢物混合物，本研究主要关注其商业化价值最高的部位——叶片。然而，月桂的不同植物结构，包括果实（浆果）、花和树皮，也含有化学成分谱各异的EO。虽然叶部EO以高含量的桉叶油醇为特征，但果实油（通常称为“月桂浆果油”）含有大量的固定油和不同的萜烯组成，从而导致其生物活性和工业应用也各不相同。月桂不同部位及其EO被认为具有许多有趣的特性，在农业、医疗、食品、制药等多个领域具有潜在应用价值[5, 6, 7]。叶片通常用作汤、鱼、肉、炖菜、布丁、醋和饮料的香辛调味剂。自迪奥斯科里德斯时代以来，月桂叶和果实的药用特性就已为人所知[5]。由于其抗菌和杀虫活性，月桂被用作食品工业中的食品防腐剂[6, 7]。化妆品工业也在乳霜、香水和肥皂中使用月桂EO[8, 9]。EO表现出有益的功能，如抗菌、抗真菌和抗氧化活性[10]。据报道，种子具有抗溃疡和抗糖尿病作用[11]。如今，对用于新型应用的天然产品的需求与日俱增；例如，月桂浆果被用作食品、制药和化妆品行业中的天然花青素，以替代合成染料[12, 13]。
全球对EO的需求正以显著的速率（年均9.5%）增长。这种增长的需求源于EO因其有益特性而在医疗、食品与饮料、家居清洁、水疗与放松以及芳香产品等各个工业领域的广泛应用，同时也因为健康益处和最小的副作用是推动市场增长的关键因素[9, 14-22]。然而，生产EO需要大量的植物原料。例如，生产约500克玫瑰花瓣、紫丁香或柠檬的EO分别需要5000公斤、130公斤和750公斤的原料[14]。这些植物非常珍贵，且对于生物体而言数量有限。
通常，精油的产量和组成因植物的产地、采集时期和生长阶段而异[23]。因此，根据产量在正确的时间从最合适的地点采集对于提高生产力至关重要。尽管月桂的植物化学特性已在不同地区得到广泛研究，但大多数研究要么关注于孤立的季节性变异，要么关注于广阔的地理区域，或比较不同的提取方法[8, 24-27]。该物种EO的化学成分中存在显著的区域性化学型变异性[13, 24]。先前的研究表明，月桂EO的含量和/或组成存在季节性变化[25, 26, 28-31]。根据一些作者的说法，开花期是采收月桂叶的最佳时间，因为此时植物含有最高百分比的EO[32]。然而，关于月桂EO季节性变化的研究结果并不一致。一些研究植物油含量在所有四个季节变化的作者发现，在营养生长期油量更高[33]，而其他人则发现在休眠期更高[34]。先前的研究还显示，来自不同地理区域的月桂油之间差异很小或没有差异[25, 35-36]。
本研究通过同时考察土耳其锡诺普省五个区及中心区的发育（物候期）和地理位置差异，解决了文献中的一个重要研究空白。通过系统地分析36个独特的数据集（6个地点 × 6个月），本研究为理解单一省份内的微气候和地理因素如何影响月桂EO的化学一致性以及生物活性（抗氧化和抗菌）提供了一个新的视角。这种综合方法为优化采收时间和地点以进行高质量工业生产提供了至关重要的数据。据研究人员所知，文献中的其他研究仅比较了时间或地点。尚未发现任何研究同时比较两者，并拥有如此丰富的数据集，且同时比较EO含量和生物活性。此外，其他研究通常进行季节性比较，而进行月度层面微观比较的研究则相对有限。
本研究旨在结合现有文献，确定具有高医疗和经济价值的月桂的最佳采收时间和地点。为此，研究人员比较了从不同地点和不同时期采集的样本的EO产量、组成和生物活性。此外，本研究旨在强调药用和芳香植物变异性的重要性，特别是环境和发育因素如何影响其化学谱。
**材料与方法**
**植物材料**
月桂叶样本由O. Elkiran博士于2023-2024年植被期（2023年10月至2024年3月，连续六个月）从土耳其锡诺普省内的六个不同地点（中心区及五个行政区：阿扬吉克区、埃尔费莱克区、特尔凯利区、迪克门区和盖尔泽区）采集。采集点的精确地理坐标如下：锡诺普中心（42°1′10.38″N, 35°7′43.37″E）、阿扬吉克区（41°56′29.73″N, 34°34′2.76″E）、埃尔费莱克区（41°52′47.47″N, 34°54′50.56″E）、特尔凯利区（41°55′51.79″N, 34°19′15.05″E）、迪克门区（41°38′52.05″N, 35°16′28.51″E）和盖尔泽区（41°49′49.04″N, 35°8′50.68″E）（图1）。样本根据采集地点和月份进行编码（例如，A-O代表阿扬吉克区十月），以便进行系统比较。共系统性地采集了36个样本，以评估发育（季节性）和地理位置因素对EO谱的综合影响。植物材料由分类学家O. Elkiran博士参照《土耳其植物志》第7卷进行了鉴定[37]。采集点所在地的平均温度见表1。
**精油的分离**
使用Clevenger型装置对干燥的月桂叶（每份样本100克）进行3小时的水蒸气蒸馏，以获得EO。蒸馏在恒定的100°C温度下进行。提取的EO储存于4°C的琥珀色玻璃瓶中直至分析。所得EO的体积范围为0.5 mL至1.5 mL，提取率为0.5%-1.5% (v/w)。
**色谱分析**
使用配备RXI-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径 × 0.25 µm膜厚）的岛津GCMS-QP2010系统分析EO的化学成分。氦气（纯度99.999%）以1.0 mL/min的恒定流速作为载气。分析时，将1 µL每种EO样本（用正己烷按1:100 v/v稀释）以分流模式（分流比1:50）进样，进样口温度维持在250°C。柱温箱程序初始温度为40°C（保持4分钟），然后以3.8°C/min的速率升至240°C，并在该温度下保持53分钟。挥发性组分的鉴定通过与Wiley和NIST电子质谱库中存储的质谱图进行比较来完成。已鉴定组分的相对百分比基于GC-FID（火焰离子化检测器）峰面积计算，未使用校正因子[39, 40]。
**生物活性**
**抗氧化活性**
EO的抗氧化活性通过Elkiran等人先前验证的方法进行测定[41]。简要方法如下：评估EO对稳定自由基1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）的抗氧化活性。使用系列稀释程序将EO稀释至不同浓度（500–31.25 µL/mL）。在每个浓度下，将4 mL 0.1 mM的DPPH溶液与1 mL EO的乙醇溶液混合。这些样品在室温黑暗中放置半小时。在517 nm处测量吸光度。使用以下公式计算DPPH自由基清除率：%抑制率 = [(A
B - A
S) / A
B] × 100。在此方程中，A
S代表测试样品的吸光度，A
B代表对照反应的吸光度。使用抗坏血酸（500–31.25 µg/mL）作为阳性对照。使用不含样品或标准品的化学试剂作为空白。清除活性用半数抑制浓度（IC
50）表示，即抑制50%自由基清除活性所需的提取物浓度（µL/mL）。使用Microsoft Office Excel 2019绘制图表和计算标准差（±）。
**抗菌活性**
**纸片扩散法**
使用纸片扩散法评估月桂叶EO对四种革兰氏阳性菌、三种革兰氏阴性菌和两种真菌的抗菌活性[41,42,43]。过夜细菌培养物在Mueller–Hinton肉汤（MHB）中生长，真菌培养物在沙氏葡萄糖肉汤（SDB）中生长。将每种培养物的浊度调整至匹配0.5麦氏标准（约1.5 × 10
8 CFU/mL）。使用新鲜制备的无菌Mueller–Hinton琼脂（用于细菌）和沙氏葡萄糖琼脂（用于真菌）平板，通过将约10
6 CFU的每种微生物涂布在表面进行接种。将无菌纸片（直径6 mm）浸渍25 µL EO样本，并在层流柜中完全干燥。然后将干燥的纸片放置在接种的琼脂表面。细菌平板在37°C培养24小时，而真菌平板在28°C培养48小时。使用无菌蒸馏水作为阴性对照，使用氨苄西林（AM10）和庆大霉素（CN10）作为细菌的阳性对照，使用环己酰亚胺（Cyc）作为真菌的阳性对照。培养后，以毫米为单位测量抑菌圈直径。
**最低抑菌浓度（MIC）的测定**
使用96孔微量板中的微量稀释技术，随后进行琼脂培养以确认微生物生长抑制，来测定EO的最低抑菌浓度（MIC）。将EO储备液在Mueller–Hinton肉汤（用于细菌测定）和沙氏葡萄糖肉汤（用于真菌测定）中进行系列稀释，以获得一系列浓度。每个孔加入特定浓度的EO溶液和标准化的微生物接种物（约10
6 CFU/mL）。微量板在37°C（用于细菌）和28°C（用于真菌）下孵育适当时间。孵育后，通过观察浊度对微生物生长进行视觉评估，并在必要时进行琼脂平板传代以确认抑制。完全抑制可见微生物生长的最低EO浓度被记录为MIC值。
**统计分析**
为评估月桂EO产量、化学成分和生物活性中发育和位置变异是否具有统计学显著性，根据参数检验的前提条件是否满足，应用了单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal–Wallis H检验。在所有推断性分析之前，使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，该检验适用于小至中等样本量。当满足正态性假设时，进行单因素ANOVA，随后进行Tukey’s诚实显著差异（HSD）事后检验以识别组间的成对差异。对于违反正态性假设的变量，采用非参数Kruskal-Wallis H检验，随后使用Holm-Bonferroni校正进行成对比较以控制家族错误率。为了阐明EO产量、化学成分和生物活性在采样时期和地点之间的关系，计算了斯皮尔曼等级相关系数（双尾），因为多个变量呈非正态分布。进行了主成分分析（PCA）以降低数据维度并阐明矿物浓度和选定生态参数之间的相互关系。保留特征值大于1的成分用于进一步解释。所有统计分析均使用OriginPro 2026（64位）进行。
**结果与讨论**
在本研究中，研究人员检查了代表6个不同地点并在6个月内采集的共36个样本的EO，并进行了GC-MS分析。从每份样本的100克风干叶中提取的EO得率为0.5%至1.5% v/w，具体取决于地点和采收期。根据GC-MS分析结果，检测到10-22种含量大于0.5%的化学成分。结合质谱图和保留指数（RI），鉴定了总油量的98.9%–85.7%。桉叶油醇、乙酸松油酯和顺式-桧烯水合物（cis-sabinene hydrate）在所有EO中均被普遍检出。主要优势成分为桉叶油醇（43.9–65.5%）、乙酸松油酯（7.7–15.4%）和桧烯（2.4–12.6%）（表2）。
本研究发现，主要成分桉叶油醇在10月和11月的含量高于其他月份。在埃尔费莱克区，11月份的桉叶油醇含量最高（65.5%）。有趣的是，同一地区12月份的样本中含量最低（43.9%）。在关于月桂EO的文献综述中，发现主要成分是桉叶油醇[13, 32, 45-48]。当检查各地点之间的平均温度时，埃尔费莱克区在过去6个月内的平均温度最低（表1）。桉叶油醇水平在埃尔费莱克区11月采集的样本中最高，这表明仅凭温度不足以确定EO成分的变异。然而，桉叶油醇水平在高温时期普遍较高，证明了温度是一个重要因素[49]（图1）。Kremer等人的一项研究也发现，在温暖时期桉叶油醇含量更高，与本研究一致[25]。同样，在土耳其进行的研究发现，地中海地区的月桂样本比黑海地区的样本含有更高水平的桉叶油醇[33, 50]。研究人员看到，这种差异可能是由区域间的温差引起的，高温平均值增加了月桂的桉叶油醇产量。
另一个主要成分乙酸松油酯在1月份从埃尔费莱克区采集的样本中浓度最高（15.4%），在11月份从迪克门区采集的样本中浓度最低（7.7%）。第三个主要成分桧烯在1月份特尔凯利区浓度最高（12.6%），在盖尔泽区同月浓度最低（2.7%）。桧烯是另一个主要成分。它在盖尔泽区1月份含量最低，在特尔凯利区含量最高。这一结果表明，仅凭气温不足以确定EO含量，土壤结构和其他地理条件也起着作用。文献中的类似研究也列出桧烯作为主要成分[51]。
从锡诺普地区获得的已鉴定油中九种最丰富组分的季节性变化见图2和3。本研究中鉴定的其他重要化合物包括α-蒎烯（α-pinene）（5.3–1.9%）、芳樟醇（linalool）（5.2–0.8%）、松油烯-4-醇（Terpinen-4-ol）（4.7–1.4%）、β-蒎烯（β-pinene）（4.2–2.0%）、α-松油醇（α-Terpineol）（4.0–0.5%）和顺式-桧烯水合物（cis-sabinene hydrate）（2.9–0.7%）。
比较不同站点（区域）间的EO组成显示出几种组分的显著区域差异（图2）。根据单因素ANOVA结果，α-蒎烯（p=0.002）、桧烯（p<0.001）、β-蒎烯（p<0.001）和乙酸松油酯（p=0.036）在不同站点间差异显著，而桉叶油醇、顺式-桧烯水合物和α-松油醇未显示出统计学上的显著差异（p>0.05）。事后比较表明，盖尔泽区的桧烯含量（5.82 ± 1.77）显著低于阿扬吉克区（8.48 ± 1.49）、埃尔费莱克区（8.65 ± 0.95）、特尔凯利区（10.46 ± 1.55）和中心区（8.67 ± 0.57）（p<0.05）。同样，β-蒎烯含量在中心区（2.62 ± 0.40）和埃尔费莱克区（3.13 ± 0.59）之间差异显著，在盖尔泽区（2.24 ± 0.19）与阿扬吉克区（3.47 ± 0.45）及埃尔费莱克区（3.13 ± 0.59）之间差异显著，以及在迪克门区（2.63 ± 0.38）和阿扬吉克区（3.47 ± 0.45）之间差异显著（p<0.05）。
对于不满足参数假设的化合物，Kruskal-Wallis检验揭示了芳樟醇（p=0.026）和松油烯-4-醇（p=0.006）的显著区域差异。成对比较显示，芳樟醇含量在中心区（1.58 ± 0.45）和特尔凯利区（2.93 ± 0.75）、特尔凯利区（2.93 ± 0.75）和阿扬吉克区（1.60 ± 0.55）、盖尔泽区（2.90 ± 1.47）和中心区（1.58 ± 0.45）、盖尔泽区（2.90 ± 1.47）和阿扬吉克区（1.60 ± 0.55）、迪克门区（2.87 ± 1.55）和中心区（1.58 ± 0.45）、迪克门区（2.87 ± 1.55）和阿扬吉克区（1.60 ± 0.55）之间存在显著差异（p<0.05）。此外，松油烯-4-醇含量在盖尔泽区（3.27 ± 0.86）和迪克门区（2.77 ± 0.86）显著高于特尔凯利区（1.73 ± 0.26），同时特尔凯利区（1.73 ± 0.26）和埃尔费莱克区（2.95 ± 0.85）之间、盖尔泽区（3.27 ± 0.86）和阿扬吉克区（2.68 ± 0.66）之间也存在显著差异（p<0.05）。月桂EO成分的地点分析表明，几种单萜烃和含氧单萜在六个采样区之间变化显著。这些模式表明，月桂EO的化学谱在锡诺普省并不统一；相反，特定成分浓度的区级差异在统计学上是可证明的，表明同一省内的地理位置构成了一个有意义的成分变异来源。
对月度变化的分析显示，大多数组分在采样期间未表现出统计学上的显著差异（图2）。根据单因素ANOVA，仅桉叶油醇（p<0.001）和乙酸松油酯（p=0.017）表现出显著的时间变异性，而α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、顺式-桧烯水合物和α-松油醇在各月份间无显著差异（p>0.05）。非参数Kruskal–Wallis分析也显示芳樟醇（p=0.921）和松油烯-4-醇（p=0.093）无显著的月度变化。事后比较显示，桉叶油醇含量在1月（49.77 ± 2.39）和10月（59.73 ± 4.94）（p<0.01）、1月（49.77 ± 2.39）和11月（61.50 ± 4.22）（p<0.01）、以及2月（52.37 ± 4.42）和11月（61.50 ± 4.22）（p=0.020）之间差异显著。此外，乙酸松油酯在1月（13.72 ± 1.24）和11月（9.72 ± 1.64）之间显示出显著差异（p<0.01）。虽然松油烯-4-醇的总体检验在统计学上不显著，但探索性成对比较表明3月（3.10 ± 0.77）和10月（1.98 ± 0.34）（p=0.017）、2月（2.98 ± 0.69）和10月（1.98 ± 0.34）（p=0.032）、3月（3.10 ± 0.77）和11月（2.15 ± 0.74）（p=0.041）、12月（2.94 ± 1.21）和10月（1.98 ± 0.34）（p=0.049）之间存在差异。月度变化分析表明，时间对EO组成的影响主要限于桉叶油醇和乙酸松油酯，它们表现出相反的季节性轨迹：桉叶油醇在初秋达到峰值，在仲冬下降，而乙酸松油酯在较冷的月份积累更明显。其余组分在采样期间未表现出统计学上显著的月度变化，表明其具有相对的时间稳定性。
此外，α-蒎烯、β-蒎烯和芳樟醇等单萜的存在和比例与先前的研究相似[51, 52]。总体而言，桉叶油醇的最高浓度出现在11月埃尔费莱克区（65.5%），而6个月期间的最高平均浓度出现在盖尔泽区（59.1%）。樟烯（Camphene）、月桂烯（Myrcene）、γ-松油烯（γ-Terpinene）、松油烯-4-醇和α-松油醇是在本研究中发现含量最低的化合物（0.5-4%）。在土耳其和其他国家进行的研究中也获得了类似结果[13]。
与阳性对照抗坏血酸（IC
50 = 65.2 µL/mL）相比，样本的IC
50值约为其两倍或更高，范围在119.8至426.8 µL/mL之间。在测试的样本中，12月盖尔泽区（125.3 µL/mL）、11月特尔凯利区（119.8 µL/mL）、1月迪克门区（125.6 µL/mL）、1月盖尔泽区（133.6 µL/mL）、2月盖尔泽区（130.8 µL/mL）和2月中心区（137.3 µL/mL）表现出相对于其他样本更接近抗坏血酸的抗氧化活性。当比较各区域时，12月采集的样本通常表现出较高的抗氧化活性（IC
50值在125.3至199.8 µL/mL之间）。更详细的分析还揭示了同月内获得的样本之间抗氧化活性存在相当大的变异性。例如，在2月，阿扬吉克区样本的IC
50值为352.8 µL/mL，而盖尔泽区样本表现出明显较低的IC
50值130.8 µL/mL。（表3）。使用Kruskal–Wallis检验比较各采样区的评价参数未发现任何统计学上的显著差异（p=0.524）。与该结果一致，随后的成对比较也未显示任何区对之间存在显著差异（p>0.05）。这些发现表明，所研究的变量在所有采样地点之间保持相对一致（阿扬吉克区240.71 ± 83.66；埃尔费莱克区197.17 ± 56.41；特尔凯利区166.50 ± 26.63；中心区231.86 ± 86.33；盖尔泽区208.44 ± 83.65；迪克门区326.04 ± 79.39）（图4a）。此外，IC
50值（µL/mL）在各月份间总体上无统计学显著差异（p=0.051）。然而，探索性成对比较表明某些月份对之间存在显著差异。具体而言，在3月（213.67 ± 105.42）和12月（266.00 ± 115.92）（p<0.001）、3月（213.67 ± 105.42）和11月（238.69 ± 66.45）（p<0.01）、3月（213.67 ± 105.42）和2月（197.59 ± 90.63）（p<0.01）、以及3月（213.67 ± 105.42）和1月（209.76 ± 57.87）（p=0.032）之间观察到显著差异。其余月份对之间未发现显著差异（p>0.05）（图4b）。抗氧化活性在不同采样区之间没有显著变化，表明锡诺普省内的地理位置对EO的自由基清除能力没有显著影响。关于月度变化，尽管总体Kruskal–Wallis检验未达到显著性（p=0.051），但探索性成对比较显示，与之前的冬季月份相比，3月始终产生较低的IC
50值——因此具有更高的抗氧化活性。鉴于总体检验不显著，这些成对应谨慎解释。
许多研究在不同地区对月桂EO的抗氧化活性进行了研究。考虑到生态差异，直接比较可能不合理，但预计至少在评估其生物活性方面具有参考价值。从这个角度审视，已经有许多研究使用不同的提取技术研究了该植物不同部位（种子、根、茎、叶等）的抗氧化活性，并报道了其抗氧化能力的存在。以下是与本研究同期发表的一些研究，它们发现了抗氧化活性的存在，尽管低于阳性对照抗坏血酸。Saab等人使用DPPH技术研究了月桂种子和叶EO的抗氧化活性，并报道了与抗坏血酸相比有效的结果[53]。将本研究结果与该研究进行比较，研究人员可以说，在抗坏血酸作为阳性对照的背景下，我们检测到了显著更高的活性。Beyene等人报道了从埃塞俄比亚采集的月桂叶的甲醇和脂肪酸提取物具有显著的抗氧化能力[35]。Dobroslavić等人在研究中，旨在使用微波、超声波和热回流辅助的绿色及常规方法从月桂叶中获得提取物，并检查其抗氧化能力[36]。他们报道该植物提取物具有高抗氧化能力，使用热回流辅助方法达到最佳效果。Mssillou等人报道了从摩洛哥采集的月桂花EO具有高抗氧化活性[36]。考虑到研究人员使用的DPPH方法和他们比较的阳性对照，可以说本研究结果包含更高的抗氧化能力。Dias等人研究了野生和栽培月桂叶的抗氧化能力和营养成分，报道野生品种具有高营养含量，而栽培类型具有高抗氧化能力[54]。Altın等人指出，他们从梅尔辛省采集的月桂叶具有有效的抗氧化能力，这归因于其高酚类含量[15]。Nabiha等人研究了从突尼斯采集的月桂花蕾提取物的抗氧化能力，并报道其比用作阳性对照的丁基羟基茴香醚更有效[55]。他们强调这也是由于其含有高水平的丁香酚、榄香素和甲基丁香酚。Ramos等人研究了从葡萄牙采集的月桂植物的EO、乙醇提取物和冷/热水提取物的生物特性，报道EO在抗氧化能力方面表现出最低的活性[56]。在另一项研究中，Belasli等人调查了从阿尔及利亚采集的月桂植物的EO的抗氧化活性，发现当与阳性对照比较时，他们的结果与本研究平行[57]。
在本研究中，通过纸片扩散法评估了从月桂叶中获得的EO对四种革兰氏阳性菌、三种革兰氏阴性菌和两种真菌的抗菌效果。当将研究结果与现有文献进行比较时，观察到了显著的相似性和差异性。表4所示结果表明，月桂叶EO具有广谱抗菌谱；然而，其有效性取决于微生物类型和样本采集时间。使用Kruskal-Wallis检验评估了从不同区获得的EO的抗菌活性。对于蜡样芽孢杆菌（B. cereus）（p=0.722）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）（p=0.835）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）（p=0.271）、大肠杆菌（E. coli）（p=0.512）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）（p=0.747）或铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）（p=0.833）未检测到各区之间存在统计学显著差异。相反，对粪肠球菌（E. faecalis）观察到显著的区域变异（p<0.01）。成对比较显示，迪克门区的抑制圈值（15.17 ± 9.77）与特尔凯利区（10.83 ± 2.56）（p<0.01）、阿扬吉克区（10.00 ± 1.10）（p=0.046）和埃尔费莱克区（10.00 ± 0.63）（p=0.046）记录的值显著不同，而未检测到其他成对差异（p>0.05）（图5b）。关于季节性变异，对大肠杆菌（E. coli）观察到月份之间的统计学显著差异（p=0.006）。成对比较表明12月（8.67 ± 0.82）和10月（12.67 ± 1.97）（p<0.001）、1月（9.17 ± 0.98）和10月（12.67 ± 1.97）（p<0.001）、2月（9.50 ± 1.52）和10月（12.67 ± 1.97）（p<0.01）、3月（11.00 ± 2.19）和12月（8.67 ± 0.82）（p=0.014）、11月（10.50 ± 1.38）和10月（12.67 ± 1.97）（p=0.022）之间存在显著差异。对于肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae），总体Kruskal–Wallis检验未揭示月份之间存在统计学显著差异（p=0.071）。然而，探索性成对比较提示1月（24.00 ± 14.75）和10月（12.00 ± 0.00）（p<0.01）、1月（24.00 ± 14.75）和12月（15.00 ± 4.69）（p=0.044）、1月（24.00 ± 14.75）和11月（15.00 ± 2.45）（p=0.044）之间可能存在差异（图5a）。针对大多数测试微生物的抗菌活性在各区或各月份之间没有显著变化，表明在整个采样矩阵中具有普遍一致的抑制谱。一个显著的例外是粪肠球菌，迪克门区对其产生的抑制圈显著高于特尔凯利区、阿扬吉克区和埃尔费莱克区，表明该地区对该生物的活性存在区特异性增强。关于季节性变异，对大肠杆菌的抑制在10月相对于冬季月份显著更强，指向初秋的活性时间峰值。对于肺炎克雷伯菌，尽管总体检验不显著，但探索性比较提示1月的抑制增强；鉴于缺乏确认的总体显著性，该模式应谨慎解释。
总体而言，EO对革兰氏阳性菌表现出更强的抗菌活性，对革兰氏阴性菌的活性较低。这种差异主要归因于革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖（LPS）层，它作为天然屏障限制了疏水性EO组分的穿透[58]。与这一机制一致，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性菌种观察到的大抑制圈（15-24 mm）表明EO组分可以更轻易地穿透其细胞壁并发挥抗菌作用。某些样本中观察到的显著较高活性表明EO化学成分存在差异。收获时间、气候条件、土壤特征、植物年龄和蒸馏方法等因素可能影响挥发性化合物的比例。即使是相同编码的样本也显示出活性差异，表明月桂的代谢谱对环境条件高度敏感。与这些观察结果一致，本研究中从月桂叶获得的EO对革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌）表现出较高的活性，而革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌）和某些真菌的敏感性较低（表5）。当将本研究结果与先前研究进行比较时，Fidan等人报道了从保加利亚采集的月桂叶、嫩枝和果实EO在化学成分和抗菌活性上表现出器官依赖性差异[51]。叶部EO（得率3.25%）得率最高，主要成分为桉叶油醇和乙酸松油酯，对革兰氏阳性菌有效，而嫩枝EO仅对金黄色葡萄球菌有活性，革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、大肠杆菌）更具抗性。同样，Yilmaz等人报道了来自安塔基亚-哈泰的叶部EO含有51.8%桉叶油醇、11.2%乙酸松油酯和10.1%桧烯，表现出强大的抗菌、抗真菌和抗氧化活性[59]。Ouibrahim等人也强调了桉叶油醇的作用以及EO中萜烯之间的协同相互作用[60]。本研究结果与这些研究一致：叶部EO中高含量的桉叶油醇和芳樟醇可能解释了观察到的对革兰氏阳性和阴性菌的抑制作用。尽管环境和区域因素导致样本间存在微小的成分差异，但研究结果与先前报道一致，支持了月桂叶EO一致的抗菌和抗真菌潜力。总体而言，这些结果强调了月桂叶EO的抗菌潜力主要由其化学成分决定，并提供了一个将本研究结果与先前文献相结合的数据驱动的解释。
**相关性分析**
进行了斯皮尔曼相关性分析以检查温度、主要EO成分、抗氧化活性（IC
50）和抗菌活性之间的关系（图6）。在化学成分之间，鉴定出几个统计学显著的相关性。α-蒎烯与β-蒎烯表现出强烈的正相关（r=0.86, p<0.001），与桧烯表现出中度正相关（r=0.43, p<0.05），而与桉叶油醇表现出强烈的负相关（r=−0.86, p<0.001）。同样，β-蒎烯与桉叶油醇呈显著负相关（r=−0.55, p<0.001），与乙酸松油酯呈正相关（r=0.63, p<0.001）。桧烯与桉叶油醇呈负相关（r=−0.44, p<0.05），松油烯-4-醇也与桉叶油醇表现出显著的负相关（r=−0.40, p<0.05）。温度与几个变量显著相关。温度与桉叶油醇呈正相关（r=0.49, p<0.01），而与松油烯-4-醇呈显著负相关（r=−0.54, p<0.001）。此外，温度与粪肠球菌（r=0.38, p<0.05）和大肠杆菌（r=0.41, p<0.05）表现出显著的正相关。关于抗菌活性，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌之间检测到强烈的正相关（r=0.74, p<0.001），表明这两个物种具有相似的抗菌反应模式。金黄色葡萄球菌与大肠杆菌（r=0.37, p<0.05）和铜绿假单胞菌（r=0.43, p<0.01）表现出显著的正相关，在大肠杆菌和铜绿假单胞菌之间也观察到中度正相关（r=0.33, p<0.05）。相比之下，IC
50值与大多数化学成分或抗菌变量未产生统计学显著相关，表明抗氧化活性独立于所研究的大多数参数变化。总的来说，相关性分析揭示了两个主要模式：（i）几种单萜类化合物（特别是α-蒎烯、β-蒎烯、桧烯和桉叶油醇）之间存在显著的相互关系；（ii）多种抗菌反应之间存在正相关。温度进一步成为一个影响化学成分和某些抗菌反应模式的变量。
相关性分析显示，桉叶油醇浓度与共存的单萜烃α-蒎烯、β-蒎烯和桧烯的浓度呈负相关，表明这些成分之间存在竞争性的生物合成关系。温度成为一个结构性变量，与桉叶油醇正相关，与松油烯-4-醇负相关，这与月度变化分析中观察到的季节性模式相符。对系统发育相关生物体的抗菌反应倾向于正向共变，而IC
50值与化学成分或抗菌活性均无有意义的关联，表明抗氧化能力独立于其他测量参数运作。
**主成分分析（PCA）**
主成分分析（PCA）用于考察温度、主要EO成分、抗氧化活性（IC
50）和抗菌活性之间的多变量关系。前五个主成分（PCs）共同解释了总变异的80.23%（PC1: 27.90%, PC2: 20.43%, PC3: 13.39%, PC4: 11.49%, PC5: 7.03%），表明数据集被这些成分充分代表。PC1和PC2的双标图（biplot）共同解释了总变异的48.33%，提供了变量之间关系的直观表示（图7）。PC1（27.90%）主要表现为桉叶油醇与单萜烃α-蒎烯和乙酸松油酯在另一端的对立，另一端是温度、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌。这种模式表明，桉叶油醇含量较高的样本与较高的温度和对某些革兰氏阴性菌的更强活性相关，而富含α-蒎烯和乙酸松油酯的样本往往出现在较冷的条件下。桉叶油醇在双标图中指向正PC1轴方向的长箭头，直观地证实了其在构建该维度中的主导作用。PC2（20.43%）由蒎烯型单萜主导：β-蒎烯的正载荷最高，其次是α-蒎烯和桧烯，而松油烯-4-醇和α-松油醇负载荷为负。在双标图中，β-蒎烯、α-蒎烯和桧烯向量向上移动的轨迹，都指向左上象限，反映了它们在样本中的共同出现，与斯皮尔曼分析中报道的这些化合物之间的强正相关一致。相反，松油烯-4-醇和α-松油醇向下投影，表明沿该成分与蒎烯型馏分呈负相关。温度和大多数抗菌变量（特别是蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）聚集在双标图的右上象限，其向量指向大致与温度相同的方向（图6）。这种位置分组意味着较高的温度与多种细菌菌株的抗菌反应模式之间存在共享的正相关，证实了斯皮尔曼分析中确定的温度-抗菌相关性。肺炎克雷伯菌是一个显著的例外，其向量指向图的下部，表明与其他测试生物体相比具有不同的反应模式。IC
50值由一个靠近双标图原点的短向量表示，表明对PC1和PC2的贡献微弱，证实了抗氧化活性未与任何化学或生物变量的主导分组一致对齐。这一发现与IC
50与大多数其他参数之间无显著斯皮尔曼相关性相符。总而言之，PCA结果揭示了数据集中的两个主要变异轴：第一轴将桉叶油醇富集的样本（与较高温度相关）与α-蒎烯和乙酸松油酯占优势的样本（特征为较冷条件）区分开来；第二轴反映了单萜馏分内部的分化，特别是β-蒎烯/桧烯组与含氧单萜亚组（松油烯-4-醇、α-松油醇）之间的分化。这些模式共同强调了季节性温度变化对月桂EO化学成分和生物活性的影响。PCA证实了斯皮尔曼分析中确定的两个主要变异轴：PC1将桉叶油醇富集的样本（与较高温度相关）与α-蒎烯和乙酸松油酯占优势的样本（特征为较冷条件）区分开来，而PC2将蒎烯型烃馏分与含氧单萜亚组区分开来。抗氧化活性（IC
50）对两个轴的贡献均很小，强化了其与其他变量的独立性。肺炎克雷伯菌偏离了普遍的抗菌聚类模式，表明与其他测试生物体相比具有不同的反应谱。
**结论**
本研究对锡诺普省六个采样地点的月桂叶EO进行了综合的区级表征，持续六个月，同时考察了发育和地理位置的变异来源——据研究人员所知，这是针对该物种首次报道此类设计。主要发现是，地理环境比采收月份构成更统计学一致的化学成分变异驱动因素，证实了六个主要成分（包括桧烯、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇和松油烯-4-醇）存在显著的区际差异。时间影响仅限于桉叶油醇和乙酸松油酯，它们在整个研究期间遵循相反的季节性轨迹。基于EO产量、化学成分和生物活性的综合分析，埃尔费莱克区和盖尔泽区的10月和11月采收被确定为最适用于需要高桉叶油醇含量（最高达65.5%）和相对较强的自由基清除能力（IC
50低至119.8 µL/mL，特尔凯利区-11月）的应用的最具潜力的组合。对于以对革兰氏阳性菌的抗菌效力为优先考虑的应用（如芽孢杆菌属和肺炎克雷伯菌的MIC值低至320 µg/L所示），沿海地区的秋季采样同样显示出优势。这些观察结果对于优化以天然防腐剂、药品或化妆品配方为目标的月桂栽培的采收计划和地点选择具有直接的实际意义。总而言之，研究结果为开发具有可重现性和靶向生物活性谱的月桂标准化EO制剂提供了科学依据。尽管如此，本研究仍存在一定的局限性。数据集仅涵盖一个生长季，需要多年重复才能确认观察到的地点和时间模式是否跨年稳定或对年际气候波动有响应。此外，仍需进行微量成分浓度与特定生物活性终点之间的更广泛相关性分析。未来的研究应探索微量类萜对总体抗菌和抗氧化功效的协同贡献，并考虑将采样框架扩展到其他省份，以评估这些区域内发现的普遍性。
