有氧运动诱导的转化生长因子-β（TGF-β）受体重编程通过破坏中性粒细胞–小胶质细胞串扰减轻蛛网膜下腔出血后早期脑损伤

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）急性期快速进展的神经炎症与早期脑损伤是导致高疾病严重度和高病死率的重要原因。尽管队列研究已证实，有氧运动（aerobic exercise, AE）与短期死亡率下降相关，但其确切机制仍不清楚。研究人员采用接受预处理AE的小鼠SAH模型，结合早期神经功能评估与组织学染色，对上述假设进行验证。通过全转录组测序和单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），捕获差异表达基因并描绘亚型特异性分化特征。为在体外重建神经免疫串扰，研究人员建立了原代中性粒细胞–小胶质细胞共培养体系，并采用靶向受体–配体相互作用研究验证驱动二者协同激活的特定环境变量。结果表明，AE显著改善SAH后的神经功能结局、脑水肿和神经元凋亡。测序数据鉴定出经典促炎性M1样小胶质细胞，以及一种以高表达转化生长因子β₁（transforming growth factor beta 1, Tgfb1）为特征的新型早期应答小胶质细胞亚群；这两类细胞群均受AE调控以调节神经炎症，并且与浸润中性粒细胞数量显著相关。该串扰由成熟中性粒细胞来源的富亮氨酸α-2-糖蛋白1（leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1, Lrg1）介导，其可差异性激活小胶质细胞的转化生长因子-β信号通路。总体而言，AE通过抑制中性粒细胞浸润而重新平衡小胶质细胞分化，从而减轻SAH后的神经炎症。研究确定Lrg1是该过程中的关键免疫介质，提示运动诱导的受体水平重编程可作为SAH的潜在治疗策略。

本研究发表于《Research》，围绕蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）后早期脑损伤（early brain injury, EBI）的炎症机制展开。SAH是一类致死致残率极高的神经系统急症，虽然动脉瘤夹闭和血管内栓塞等治疗不断进步，但患者神经功能结局改善有限。其关键原因在于出血后72 h内迅速发生的EBI，包括神经元凋亡、血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）破坏、脑水肿及持续性神经炎症。既往研究表明，神经炎症并非单一细胞事件，而是浸润性免疫细胞与中枢固有免疫细胞协同放大的结果，尤其是中性粒细胞与小胶质细胞之间形成的正反馈炎症环，可持续加剧脑组织损害。与此同时，流行病学和队列研究提示，卒中前规律有氧运动（aerobic exercise, AE）与更低的短期死亡率及更好的功能恢复相关，但AE在SAH中的细胞与分子保护机制仍缺乏系统阐明。基于此，研究人员提出：AE预处理可能通过干预中性粒细胞–小胶质细胞致病性串扰，从而抑制神经炎症并减轻SAH后的EBI。

为验证这一假设，研究人员构建了小鼠SAH模型，并在建模前实施3周跑台AE预处理。结果显示，AE能够显著改善SAH后24 h的神经行为学结局，降低脑含水量，减轻神经元凋亡，并缓解海马及皮层组织学损伤。分子层面上，AE抑制促炎因子白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, Il-1b）、白细胞介素-6（interleukin-6, Il-6）和诱导型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase 2, Nos2）的上调，同时提高抗炎相关因子白细胞介素-4（interleukin-4, Il-4）、白细胞介素-10（interleukin-10, Il-10）及转化生长因子β₁（transforming growth factor beta 1, Tgfb1）的表达。进一步的转录组与单细胞测序分析揭示，AE的保护效应与TGF-β信号通路密切相关，并涉及小胶质细胞分化状态的重塑。研究不仅鉴定出经典促炎性MG2亚群，还发现一种高表达Tgfb1的早期激活小胶质细胞亚群MG1。SAH后MG2显著增多，MG0与MG1显著减少，而AE可部分逆转这一变化。更重要的是，小胶质细胞亚群变化与中性粒细胞浸润程度显著相关，提示两类细胞存在关键串扰轴。

作者为开展研究主要采用了以下技术方法：建立雄性C57BL/6J小鼠血管内穿孔SAH模型及Lrg1敲除（knockout, ko）小鼠模型，并实施3周强制跑台AE预处理；结合神经行为学评分、脑含水量检测、HE染色、尼氏（Nissl）染色、TUNEL免疫荧光和Western blot评价EBI；对出血周围皮层进行全转录组RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq），并进行GO、KEGG、CellChat、拟时序及蛋白互作网络分析；分离原代外周中性粒细胞和原代小胶质细胞建立Transwell共培养体系，结合SB431542干预、免疫共沉淀（Co-IP）及HEK293T受体胞外结构域互作实验解析Lrg1-TGF-β受体信号机制。样本来源包括小鼠脑组织、Lrg1-ko小鼠及新生鼠原代小胶质细胞、外周血中性粒细胞。

以下为论文结果部分的凝练解读。

AE alleviates EBI and neuroinflammation of SAH
研究人员首先在动物水平验证AE对SAH后EBI的影响。通过Modified Garcia评分和梁平衡评分（beam balance score, BBs）发现，AE预处理后的小鼠在SAH发生24 h后神经功能受损明显减轻。脑水含量测定表明，AE显著降低双侧脑半球水肿。HE和Nissl染色显示，AE减轻了出血周围皮层及海马区的组织结构破坏和神经元损伤。NeuN/TUNEL双标进一步证实，AE显著减少皮层神经元凋亡。Western blot结果则说明AE抑制了促炎分子上调，并增强了抗炎因子表达。该部分结果表明，AE可在SAH急性期显著缓解EBI及神经炎症。

AE modulates microglial differentiation via TGF-β signaling
为阐明AE发挥神经保护作用的分子基础，研究人员开展RNA-seq和scRNA-seq分析。RNA-seq显示，差异表达基因主要富集于胶质发生、胶质细胞分化调控及TGF-β信号通路，提示AE可能通过影响胶质细胞命运发挥作用。scRNA-seq显示，不同实验组之间粒细胞和小胶质细胞比例发生显著改变，且二者呈负相关；AE可减缓SAH后大量粒细胞浸润及小胶质细胞比例下降。CellChat分析提示，小胶质细胞与其他细胞间的关键信号通路之一为TGF-β，尤其以Tgfb1-Tgfbr1/Tgfbr2配对最为突出。对小胶质细胞进一步分群后发现，SAH显著减少稳态MG0和早期激活MG1，增加促炎MG2，而AE可部分恢复MG0、MG1并抑制MG2扩增，说明AE促进小胶质细胞由促炎状态向保护性状态转变。

The TGF-β signaling pathway mediated the regulation of AE on microglial differentiation of SAH
研究人员利用Alk5选择性抑制剂SB431542验证TGF-β通路的功能作用。结果表明，阻断TGF-β受体信号后，AE对神经行为学、炎症抑制和小胶质细胞表型重塑的保护作用基本消失。Western blot显示，SB431542可恢复Il-1b、Il-6和Nos2的升高。免疫荧光显示，AE降低Lpl⁺Iba1⁺促炎MG2并增加Sec24a⁺Iba1⁺早期激活MG1，而SB431542逆转这一变化。由此可见，AE对小胶质细胞分化状态的调控依赖TGF-β信号通路。进一步构建蛋白互作网络后，Lrg1成为TGF-β相关网络中连接度最高的核心节点，提示其可能是连接AE与小胶质细胞分化改变的关键分子。

AE suppresses Lrg1 expression following SAH, reducing pro-inflammatory microglial differentiation and neuroinflammation
在明确Lrg1可能为核心因子后，研究人员进一步追踪其来源及功能。scRNA-seq提示，脑内Lrg1主要来源于中性粒细胞；RNA-seq和Western blot均证实，SAH后Lrg1明显升高，而AE可抑制其表达。采用Lrg1-ko小鼠后发现，Lrg1缺失可改善神经行为学结局，降低促炎因子，提升抗炎因子，并减少Lpl⁺Iba1⁺ MG2、增加Sec24a⁺Iba1⁺ MG1。值得注意的是，SB431542能够消除Lrg1缺失带来的保护效应，说明Lrg1对小胶质细胞炎症分化的调控依赖TGF-β信号。该部分结果支持：AE通过抑制Lrg1表达而减轻神经炎症，并促使小胶质细胞向相对保护性的分化方向偏移。

ScRNA-seq data suggested that mature neutrophils highly expressed Lrg1, involved in neutrophil adhesion
对中性粒细胞进行进一步单细胞亚群分析后，研究人员发现成熟中性粒细胞亚群中Lrg1表达最高，并随细胞激活和分化而逐渐下降。拟时序分析显示，Neu1处于成熟阶段，Lrg1高表达与其成熟状态一致。功能富集分析表明，Neu1高变基因涉及白细胞间黏附及对内皮细胞黏附等过程，提示Lrg1可能参与中性粒细胞浸润与黏附。组织双荧光染色证实，AE或Lrg1缺失均可减少出血周围皮层Ly6G⁺中性粒细胞浸润。结合相关性分析结果，研究表明中性粒细胞数量与MG1负相关、与MG2正相关，提示中性粒细胞不仅是Lrg1来源，也与小胶质细胞促炎重塑直接相关。

Lrg1 secreted by primary neutrophils differentially activates Tgfbrs of primary microglia
为重建细胞间串扰，研究人员建立了原代中性粒细胞–原代小胶质细胞共培养体系。结果显示，无论小胶质细胞基因型如何，野生型中性粒细胞均可诱导小胶质细胞促炎分化，表现为Il-1b、Il-6、Nos2升高，Alk1–Smad1/5信号增强，同时Il-4、Il-10、Tgfb1下降，Alk5–Smad2/3信号受抑。相反，Lrg1-ko中性粒细胞显著减弱这一促炎效应，并部分恢复抗炎相关信号和Smad2/3磷酸化。表型上，野生型中性粒细胞增加Lpl⁺Iba1⁺小胶质细胞比例，而Lrg1缺失中性粒细胞则降低促炎分化并促进Sec24a⁺Iba1⁺细胞增加。该部分直接证明，中性粒细胞来源Lrg1是驱动小胶质细胞促炎极化与维持神经炎症的重要信号。

Lrg1 transduced Alk5/Alk1 receptor signals via Tgfb1 and Eng
在机制解析层面，研究人员进一步通过Co-IP和HEK293T受体胞外结构域实验分析Lrg1与TGF-β受体复合体的结合模式。结果表明，Lrg1免疫沉淀物中可检测到Alk1、Alk5、Tgfb1、Tgfbr2和内皮糖蛋白（endoglin, Eng）。外源表达系统证实，Lrg1可直接结合Alk5和Eng，但不能单独直接结合Alk1。进一步组合实验显示，Eng是Lrg1与Alk1结合所必需的，而Tgfb1与Tgfbr2可增强Lrg1–Alk1相互作用，同时抑制Lrg1–Alk5结合。说明Tgfb1能够促进Lrg1/Alk1/Tgfbr2/Eng复合体形成，从而使信号由Alk5–Smad2/3轴转向Alk1–Smad1/5轴。结合前述结果，AE的关键作用并非简单抑制炎症，而是通过降低中性粒细胞浸润和Lrg1表达，重塑TGF-β受体层面的信号输出，使小胶质细胞由促炎性受体程序转向保护性受体程序。

讨论部分总结
论文讨论部分强调，本研究揭示了SAH后一种此前未被充分认识的神经免疫调控机制，即AE通过受体水平重编程破坏中性粒细胞–小胶质细胞之间的致病性串扰，从而减轻EBI。研究的重要创新包括：发现Tgfb1^high早期应答小胶质细胞亚群；明确成熟中性粒细胞来源Lrg1是驱动小胶质细胞促炎分化的关键免疫检查点；提出AE可将Lrg1介导的信号输出从Alk1偏向Alk5，从而把促炎信号转换为保护性信号。这一发现表明，运动干预并非仅广泛抑炎，而是通过重设受体复合体与下游信号通路，提高神经免疫调控的精确性。作者同时指出，研究也存在局限，包括仅观察24 h急性期、仅使用年轻雄性小鼠、体外共培养体系无法完全模拟脑内复杂微环境，以及Lrg1糖基化和AE对外周免疫状态调控机制仍需进一步研究。

研究结论部分翻译
简言之，本研究表明，3周AE预处理可显著减轻SAH后24 h的急性神经功能缺损、脑水肿、神经元凋亡和神经炎症。机制上，浸润的外周中性粒细胞通过释放Lrg1加重EBI；Lrg1使小胶质细胞TGF-β信号偏向促炎性的Alk1轴，从而促进促炎分化并抑制Tgfb1^high表达亚群。AE干预通过减少中性粒细胞募集和Lrg1表达，减弱这一病理级联反应，进而使小胶质细胞分化重新偏向抗炎性的Alk5通路并缓解神经炎症。总体而言，这些发现将AE确定为一种有前景的非药物预防策略，可用于预先减轻SAH诱导的EBI。