铜绿假单胞菌是一种广泛存在的革兰氏阴性菌，可在易感人群中引发多种机会性感染。铜绿假单胞菌天然对许多治疗药物具有耐药性，而由生物被膜介导的感染则表现出更强的抗微生物药物耐受性。超过25年前，研究人员已经认识到铁在铜绿假单胞菌生物被膜生理中扮演着关键角色，大量研究揭示了这种金属营养素如何影响生物被膜群落的调节、结构和营养需求的机制见解。本迷你综述概述了当前领域内关于铁对铜绿假单胞菌生物被膜形成具体影响的理解现状，研究人员提出未来研究的关键领域，以便更有效地将这些发现与临床联系起来。
**引言**
铜绿假单胞菌是一种广泛存在的革兰氏阴性菌，可导致癌症患者发生急性肺部和血液感染，并占所有医院获得性感染的10% (1–4)。铜绿假单胞菌还会在囊性纤维化(CF)患者中引起终身的慢性肺部感染，是糖尿病和手术患者慢性伤口感染的重要贡献者 (5–7)。铜绿假单胞菌对许多治疗药物具有天然耐药性，多重耐药(MDR)菌株的出现导致持续性感染、更长的住院时间和更高的死亡率 (8, 9)。同样成问题的是由生物被膜介导的感染，这类感染对抗微生物药物、营养匮乏和宿主免疫攻击表现出更高的耐受性 (10–12)。生物被膜是聚集的且通常附着于表面的微生物群落，包裹在胞外聚合物(EPS)中，该基质由蛋白质、胞外DNA (eDNA)和多糖组成 (13–17)。EPS基质，加上生物被膜细胞较慢的生长速度和多药外排泵表达增加，有助于生物被膜对环境攻击（包括宿主免疫系统和抗生素）的耐受 (10, 12, 18)。
20多年前，Singh及其同事做出了开创性的发现：乳铁蛋白，一种哺乳动物先天免疫系统的铁螯合组分，能破坏铜绿假单胞菌生物被膜 (19)。这一发现激发了大量关于这种必需过渡金属如何影响铜绿假单胞菌从单细胞生长转变为形成生物被膜群落所需的各种机制的研究。最近的一篇综述涵盖了过渡金属（包括锰、锌和铁）对一系列微生物病原体生物被膜形成的影响 (20)。本迷你综述聚焦于当前领域内关于铁对铜绿假单胞菌生物被膜形成的具体影响的研究现状，研究人员进一步讨论旨在破坏铜绿假单胞菌生物被膜铁稳态的、不断发展的治疗策略。
**生物被膜研究的实验模型**
铜绿假单胞菌生物被膜感染包括设备介导的感染（可以是急性或慢性），以及肺部、皮肤和软组织的慢性感染。前者感染发生在铜绿假单胞菌定植于医疗设备（如导管或呼吸机）并形成生物被膜，随后生物被膜可分散并扩散到其他器官时 (21–24)。相比之下，慢性感染通常由促进微生物定植并阻止机体清除的潜在病理状况引起 (7, 11, 21, 25, 26)。一个研究充分的铜绿假单胞菌慢性感染实例是遗传性疾病囊性纤维化(CF)患者的肺部感染。CF的特征是肺部黏稠粘液积聚；最终铜绿假单胞菌的定植导致肺功能进一步下降并最终死亡 (27–29)。铜绿假单胞菌还可以在伤口床形成抗微生物耐受的生物被膜，导致持续性炎症、组织损伤和伤口愈合减慢 (7, 30, 31)。这些慢性伤口感染中最成问题的例子之一是糖尿病足溃疡，其发生源于神经损伤和循环不良；糖尿病患者血管变化、高血糖和免疫抑制进一步使溃疡的有效治疗复杂化 (7, 32)。正如预期的那样，定植、生物被膜发展和环境条件的机制在这些感染中差异很大。
设备介导的感染发生在初始附着于医疗设备的塑料表面之后 (22, 33)。相比之下，CF肺部的生物被膜通常是粘液栓内的EPS包裹聚集体 (34)，而伤口床的生物被膜则附着于宿主细胞和结缔组织 (35)。此外，慢性CF肺部环境呈弱酸性，很大程度上缺氧，并且处于体温 (36, 37)，而伤口床环境呈碱性，温度较低（33°C），氧浓度随伤口床深度而变化 (38, 39)。此外，定植于CF患者肺部的铜绿假单胞菌菌株通常过量产生多糖藻酸盐 (11)，而CF肺部的小菌落变体则过表达Pel和Psl多糖 (40, 41)。在慢性伤口感染中形成的生物被膜则更依赖于Pel和/或Psl多糖 (42)。
已经开发了多种体外生物被膜模型来研究铜绿假单胞菌生物被膜，每个模型在将研究发现与多样化的铜绿假单胞菌生物被膜感染相关联时都表现出优势和局限性（表1）。铜绿假单胞菌生物被膜容易在玻璃和模拟医院表面以及与铜绿假单胞菌感染相关的医疗设备的塑料聚合物上形成，这促进了医院内传播 (43)。在琼脂上形成的宏观菌落生物被膜也被用于研究细胞组织和空间基因表达 (44–48)。还开发了多种模拟不同感染营养特征的培养基制剂。这些制剂包括模拟受损皮肤和软组织中常见因素的类伤口培养基 (49–51)，以及模拟CF肺部环境定植的铜绿假单胞菌转录谱的合成CF培养基(SCFM)制剂 (52, 53)。此外，Moreau-Marquis等人开发了一种组织培养模型，其中铜绿假单胞菌生物被膜在携带常见CFTR突变的肺上皮细胞上形成，揭示CFTR细胞向培养基分泌铁以支持铜绿假单胞菌生物被膜形成 (54, 55)。离体模型，包括浸没在SCFM中的猪支气管组织 (56) 和提取的CF痰液 (57)，也被开发出来，允许引入在体外模型中不易整合的额外宿主因子。
一个考虑因素是生物被膜是在具有连续营养供应的开放动态系统中形成，还是在封闭的静态系统中形成。封闭的静态模型被广泛使用，特别有利于在多孔板中进行菌株、环境条件或抗微生物化合物的高通量筛选 (58, 60, 61)。这些模型成本低、简单且可重复，但其特点是营养耗竭和细菌产物积累，这些可能改变生物被膜的生长和组成。相比之下，开放的生物被膜系统提供连续的营养供应和代谢物的去除，可以控制特定变量，例如铁。可以使用蠕动泵控制培养基通过狭窄通道或流动池的连续流动，其中生物被膜在附着的玻璃盖玻片上形成。流动池生物被膜通常在25°C下培养，因为随着温度升高，管道中会形成气泡，带来技术挑战 (63)；然而，研究人员最近的工作表明，通过合适的实验设置，可以在37°C下可重复地培养铜绿假单胞菌流动池生物被膜，而不会因气泡干扰 (64)。相比之下，滴流反应器(DFR)生物被膜在营养物恒流供应下生长，废物通过重力去除，减少了流动池模型中可能改变生物被膜表型的剪切力。这个DFR模型先前曾用于研究铜绿假单胞菌在应对钙卫蛋白(CP)（一种宿主先天免疫蛋白，可螯合包括铁在内的多种过渡离子）时的金属稳态 (65)。
考虑到上述因素，体外模型的选择应由实验所要解决的生物学问题来指导。在理解铁稳态对生物被膜生理学影响的情况下，可以在流动池系统中精确控制数天的铁浓度，使研究人员能够更好地将铁调控的机制分析与铁依赖的生物被膜生理变化联系起来。在其他情况下，静态模型可能为某些生物被膜感染部位提供更真实的模型，在这些部位，由于宿主营养免疫（见下文），在生物被膜生长过程中营养限制会逐渐形成。然而，重要的是要注意，组织损伤引起的免疫活动也可能导致营养可用性增加。需要继续开发更接近模拟宿主环境（例如，组织芯片）的体外和离体生长模型，以将体外模型与感染联系起来。
在此背景下，已经开发了几种生物被膜感染模型，以捕捉促成铜绿假单胞菌生物被膜形成的全部宿主-病原体相互作用（表2）。铜绿假单胞菌感染并在模式无脊椎动物黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫中形成生物被膜 (66–69)，这有助于理解宿主先天免疫如何影响生物被膜发展 (70, 71)。大蜡螟幼虫也被用作无脊椎动物感染模型，因其成本低且能在37°C下生长 (72–74)。虽然大蜡螟感染重现了许多铜绿假单胞菌在哺乳动物模型中感染的表型发现，但铜绿假单胞菌是否同样在这种宿主中形成生物被膜尚不清楚。此外，作为一个非模式生物，可用于研究大蜡螟感染中宿主-病原体相互作用的遗传工具较少。最后，已经开发了几种小鼠感染模型来研究铜绿假单胞菌感染。小鼠模型包括一种CF肺部感染模型，其中上皮钠通道(ENaC)过表达，导致与CF相似的肺部病理 (75)，以及慢性伤口感染模型，其中铜绿假单胞菌被接种到皮肤切口中 (42, 76)。有限的体内模型已被应用于理解铁在生物被膜感染模型中的作用。一个值得注意的模型使用了缓慢杀伤(SK)秀丽隐杆线虫模型，该模型依赖群体感应并导致生物被膜在线虫肠道中生长，以及液体杀伤(LK)模型，该模型不导致肠道定植且不依赖群体感应 (77)。分析产铁载体吡咯绿素(PVD)缺陷的铜绿假单胞菌突变体显示在SK模型中衰减，但在LK模型中没有 (77)。重要的是，研究人员最近发现，生物被膜形成的铁稳态要求在37°C（秀丽隐杆线虫无法生长）与25°C下是不同的 (78)。
许多慢性假单胞菌生物被膜感染是多微生物的，包括伤口床和CF患者肺部的感染 (30, 32, 49, 79–83)。共感染病原体之间的相互作用导致抗生素耐受性和毒力潜力增加 (84–86)。几份报告揭示了铁和营养免疫进一步影响铜绿假单胞菌与其他微生物的相互作用 (65, 87–89)；然而，铁对生物被膜内种间相互作用的影响尚未得到探索。最近的工作试图确定使用上述描述的模型纳入常见共感染生物的影响 (49, 62, 76, 89–93)。尽管多微生物相互作用显著增加了这些模型的复杂性，但通过正确的对照，它们将提供对铁如何在多微生物感染背景下影响微生物相互作用的更好理解。
**铁与营养免疫**
金属对微生物生长和感染至关重要；因此，宿主的先天免疫系统会螯合包括铁在内的过渡金属，以防止微生物生长，这一过程称为营养免疫 (94)。研究最充分的铁螯合策略之一是宿主蛋白的铁螯合，例如存在于粘膜分泌物中的乳铁蛋白，它以高亲和力结合氧化的、三价铁形式Fe(III)（图1） (95)。乳铁蛋白在25°C流动池生物被膜模型中减少了铜绿假单胞菌的生物被膜生长，导致扁平的生物被膜，缺乏铜绿假单胞菌生物被膜特征性的蘑菇状结构 (19)。乳铁蛋白还抑制在37°C微量滴定板中生长的铜绿假单胞菌临床分离株的生物被膜形成 (96)。为了克服Fe(III)被先天免疫系统螯合，铜绿假单胞菌分泌两种不同的铁载体：吡咯绿素(PVD)和铁绿素(PCH)，它们以高亲和力螯合Fe(III)以竞争乳铁蛋白，并在多种急性感染模型中是完全致病性所必需的（图2） (97–99)。在25°C下进行的流动池生物被膜研究，使用了对每种铁载体生产缺陷的突变体，表明PVD，而不是PCH，对于最佳生物被膜形成是必需的 (100)。然而，最近的研究表明PCH在37°C下的表达高于25°C (101)，这提出了PCH在较高温度下生物被膜形成中可能扮演更重要角色的问题。
多项研究表明，从CF肺部分离的铜绿假单胞菌菌株中铁载体产量降低 (102, 103)，这可能是由于氧气可用性降低导致还原的、二价铁形式Fe(II)占主导地位 (104)。与这一观点一致，研究人员最近发现，删除PVD和PCH生产基因导致铜绿假单胞菌在厌氧条件下浮游生长增加 (14)。在缺氧环境中，铜绿假单胞菌可以通过FeoAB转运蛋白获取Fe(II)（图2） (105)。迄今为止，先天免疫蛋白钙卫蛋白(CP)是唯一已知的能螯合Fe(II)的宿主因子（图1） (106)。CP由中性粒细胞在感染部位释放，在那里它螯合二价过渡金属，包括Fe(II)，并在铜绿假单胞菌和其他微生物病原体中诱导铁饥饿反应 (106–109)。CP处理导致铜绿假单胞菌生物被膜形成减少，这是由于其金属螯合作用 (65)，并导致生物被膜周围形成组成未知的网状结构，这可能增强其捕获铁的能力 (90)。此外，在体外琼脂培养、小鼠肺部感染和CF肺部环境中，CP保护金黄色葡萄球菌免受铜绿假单胞菌的抗微生物活性，这两种病原体常在CF肺部和伤口床中共分离 (30, 32, 49, 79–83, 65)。最近的一项研究表明，CP对这些生物体外共培养的影响与其金属螯合功能无关 (110)，这表明CP在调节铜绿假单胞菌生物被膜形成方面具有更广泛的作用。
铜绿假单胞菌还可以介导血红素的摄取和降解 (14)，血红素是人体宿主中铁的重要来源（图2） (111)。血红素通常被封闭在细胞内，但在感染期间组织损伤时可释放 (94)。宿主产生一种称为血红素结合蛋白的蛋白质来螯合释放的血红素并将其运输到肝脏（图1） (112)。关于血红素和血红素螯合免疫功能如何影响铜绿假单胞菌生物被膜形成，我们所知甚少。然而，铜绿假单胞菌在CF肺部感染过程中已显示出向血红素摄取系统高表达进化的趋势，表明这种铁来源在CF肺部的重要性 (102, 103)。支持血红素在铜绿假单胞菌生物被膜形成中作用的一项早期研究表明，铜绿假单胞菌血红素加氧酶(HemO)的合成抑制剂（这是铜绿假单胞菌利用血红素作为铁来源所必需的）保护秀丽隐杆线虫免受铜绿假单胞菌杀伤 (113)。理解这种临床相关形式的铁在铜绿假单胞菌生物被膜生物学中的相互作用是该领域持续要解决的关键问题。
**连接铁与生物被膜形成的调控网络**
尽管铁是必需的，但它也会促进损伤生物分子的活性氧(ROS)形成，这个过程被先天免疫细胞产生的氧化剂加剧 (114)。因此，铜绿假单胞菌必须平衡其对铁的需求与限制其毒性潜力的策略。在铁缺乏的环境中，这些策略包括上调铁获取系统和下调非必需铁利用途径。随着铁水平升高，细胞必须反向影响这些系统的表达。这些系统的协调表达由铁吸收调节蛋白(Fur)介导，Fur在铁充足条件下结合许多基因的启动子区域，这些基因编码铁载体(PVD和PCH)合成和摄取、血红素摄取和降解以及Feo Fe(II)转运蛋白的蛋白质 (115–117)。Fur还抑制PrrF小调控RNA的表达，PrrF结合并促进非必需铁依赖途径的mRNA降解 (118–120)。通过这种方式，PrrF小RNA在铁变得有限时充当Fe预算者——节省Fe的使用仅用于最关键的过程。研究人员之前表明，PrrF小RNA在急性感染和慢性感染的铜绿假单胞菌临床分离株中表达 (121)。此外，在从CF患者分离的痰液中检测到高水平的PrrF小RNA，证实它们在慢性CF肺部感染期间产生 (102)。此外，PrrF小RNA是急性肺部感染模型中毒力所必需的 (121, 122)。综合来看，这些研究突出了铁调控在铜绿假单胞菌毒力中的复杂作用。
先前的研究表明，通过点突变使fur失活允许铜绿假单胞菌即使在乳铁蛋白存在下也能形成其特征性的蘑菇状生物被膜，而乳铁蛋白处理野生型亲本株则消除这些结构 (100)。在同一研究中，PrrF小RNA的缺失对生物被膜形成没有影响 (100)。值得注意的是，这两项发现都是使用在室温下生长的流动池生物被膜进行的，这促使研究人员团队确定在体温下是否会得到相同的结果。重要的是，研究人员发现PrrF小RNA确实在37°C下是铜绿假单胞菌流动池生物被膜形成所必需的，但在25°C下则不是 (78)。虽然这些研究表明铁调控途径影响铜绿假单胞菌生物被膜形成，但尚不清楚Fur和PrrF具体如何参与这一过程。下面探讨了Fur和PrrF可能影响铜绿假单胞菌生物被膜形成的几种模型。这些途径概述见图3。
*群体感应*
铜绿假单胞菌拥有三个层次化的群体感应(QS)系统，介导细胞间信号传导并在生物被膜形成中发挥不同作用。其中两个系统依赖于典型的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)调节性群体感应分子（Las和Rhl），而第三个系统依赖于烷基-4-喹诺酮(AQ)代谢物，包括PQS。铜绿假单胞菌QS系统的相互作用和调控控制的详细描述见其他文献 (123, 124)。在此，研究人员专注于涉及铜绿假单胞菌QS系统的研究及其如何促进铁依赖性生物被膜形成。早期研究表明，铁饥饿导致PQS分子的完全产生，这由PrrF小RNA调控 (118, 120)。这种调控效应通过PrrF与antR mRNA的直接相互作用发生，antR编码一个转录激活因子，负责将邻氨基苯甲酸转化为三羧酸循环中间体。邻氨基苯甲酸也是PQS生产的前体，PrrF对antR的抑制作用节省了邻氨基苯甲酸用于PQS生产 (118, 120)。研究人员最近表明，删除pqsA（编码PQS合成的初始基因）导致在37°C低铁条件下出现生物被膜缺陷，这本质上模拟了∆prrF突变体 (78)。PqsA也是HSI-2 VI型分泌系统（参与细菌间相互作用和静态培养中的生物被膜形成，这些可能与慢性感染期间的生长比摇动培养更相关）表达所必需的 (125)。在缺乏Las QS分子的菌株中，PQS在磷酸盐和铁饥饿条件下通过诱导rhl基因来促进Rhl QS分子的产生 (126)，这一发现与CF肺部的慢性感染相关，在那里Las系统经常丢失 (127)。需要在临床分离株和与慢性生物被膜感染相关的QS突变体中对这些调控途径进行详细研究，以充分理解它们如何影响感染期间的生物被膜形成。
*Rsm系统*
铜绿假单胞菌的RsmY和RsmZ小RNA在从急性感染向慢性感染表型转变中起核心作用。Rsm小RNA隔离RsmA，RsmA是一种RNA结合蛋白，抑制铜绿假单胞菌中参与生物被膜形成的各种靶基因的翻译 (128–130)。研究人员最近证实RsmY和RsmZ小RNA在铁饥饿下被诱导，并且这种调控仅在静态条件下发生 (131)。这种调控在∆pqsA突变体中被消除，进一步表明PQS在生物被膜等慢性生活方式中的重要性。第三个Rsm小RNA，RsmW，也被发现在铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中上调 (132)。虽然只有少数研究检查了RsmW小RNA，但已发表的转录组和蛋白质组学分析显示，PA4570（紧接rsmW基因上游的共转录蛋白）在铁饥饿下被诱导 (133, 134)。此外，在PA4570-rsmW转录物的启动子区域存在一个经典的Fur结合位点。总之，这些数据表明Rsm参与铁调控的铜绿假单胞菌生物被膜形成。
*环二鸟苷酸*
环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种第二信使，有助于铜绿假单胞菌在浮游和生物被膜生活方式之间的转换 (135)。铜绿假单胞菌在慢性感染期间表现出c-di-GMP产生增加，并且这种第二信使通过与转录激活因子 (136)、Rsm调控网络 (137) 和EPS合成酶 (138–140) 的相互作用来影响EPS产生和其他促进生物被膜形成的过程。c-di-GMP的细胞水平由双鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)控制，它们分别形成和降解c-di-GMP (135)。铁调控先前与铜绿假单胞菌中的c-di-GMP信号传导相关联 (141)，尽管这种联系的确切性质仍未知。研究人员实验室的工作表明，某些抗生素诱导的铜绿假单胞菌生物被膜形成（依赖于c-di-GMP信号传导） (142) 也依赖于铁和PrrF小RNA (121, 143)。最近的一份报告揭示，铁直接结合一个铁感应蛋白IsmP，以抑制其与一个DGC ImcA的相互作用 (144)；这种结合导致运动性降低和生物被膜形成增加。综合来看，这些研究表明铁至少部分通过控制c-di-GMP水平来促进生物被膜形成。
*运动性*
铜绿假单胞菌拥有多种表面附属结构，在生物被膜群落的起始、发展和分散中扮演互补角色。其中两种附属结构——鞭毛和IV型菌毛(TFP)——也有助于附着于表面的社会运动：抽搐运动和群集运动。抽搐运动依赖于TFP (145)，而群集运动同时依赖于鞭毛和TFP (146)。与生物被膜形成相反，铁对铜绿假单胞菌这两种类型的社会运动都具有负面影响 (147–149)，表明铁在铜绿假单胞菌群落“留下或离开”的决策中起关键作用。铁对社会运动的调控部分是由于铁饥饿诱导鼠李糖脂产生，从而增强了抽搐和群集运动 (149)。铜绿假单胞菌中鼠李糖脂产生的诱导会触发生物被膜分散 (149)，鼠李糖脂分泌的时间会影响生物被膜结构 (59, 149)。研究人员自己的实验室表明，PrrF小RNA在铁限制条件下有助于TFP蛋白产生和抽搐运动的诱导 (134)。此外，先前发表的使用CopraRNA工具的生物信息学分析确定了PrrF小RNA与pilQ和fimU mRNA之间的互补性 (150)，表明PrrF对抽搐运动的调控是由于PrrF小RNA与TFP mRNA转录物的直接相互作用。因此，铁对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控可能进一步与铁调控的鼠李糖脂产生和运动性变化相关联。
**铁对生物被膜基质的影响**
EPS在生物被膜生理学中起关键作用，并依赖于许多因素，包括维持基质持续存在的酶、有助于生物被膜结构和水平基因转移的eDNA，以及有助于微生物粘附、内聚和聚集的多糖 (15)。铜绿假单胞菌EPS的主要多糖是Pel、Psl和藻酸盐，每种对生物被膜基质的粘附和结构稳定性提供不同的贡献。这些贡献在不同条件和菌株中有所不同；因此，建议读者参考关于这些多糖及其对生物被膜基质贡献的更详细综述 (17, 151, 152)。研究表明，铁抑制转录调节因子AmrZ的表达，而AmrZ反过来促进Psl多糖的产生，Psl多糖本身螯合并储存铁 (153)。相比之下，铁限制增加实验室菌株中藻酸盐的产生，但不影响粘液型CF分离株中的藻酸盐产生 (154)。这些调控效应如何协调地影响感染期间的生物被膜形成、结构和稳定性仍然未知。
Yang等人的一项先前研究表明，铁限制促进细胞死亡和eDNA释放（通过一个现在称为“爆炸性细胞裂解”的过程）(155)，以促进铜绿假单胞菌生物被膜形成 (156)，这是一个看似矛盾的发现，因为已知铁限制会减少生物被膜形成 (19)。在同一研究中，低铁条件下eDNA释放和生物被膜形成增强依赖于pqsA以及pqsr（后者编码PQS形成的反应调节系统）(156)。相比之下，删除pqsL（通过AQ生物合成途径合成HQNO所必需的基因）(157) 导致低铁条件下程序性细胞死亡、eDNA释放和生物被膜形成增加 (156)。这一发现与最近的一项研究不同，该研究表明删除pqsL导致eDNA产生和生物被膜形成减少，表明HQNO促进而非阻止这些活动 (158)。重要的是，后一项研究是在LB中进行的，LB含有约40 µM铁，该浓度通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)确定（Nguyen和Oglesby，未发表数据），而前一项研究是在补充了特定浓度铁的最小培养基(AB)中进行的。此外，早期研究使用铜绿假单胞菌菌株PAO1，而后者使用菌株PA14。菌株差异是一个需要考虑的重要变量，因为每个铜绿假单胞菌菌株表现出与不同c-di-GMP信号传导效应相关的不同生物被膜起始方式 (159)。因此，需要更多的工作来阐明铁在eDNA释放中的作用，并确定这如何影响铜绿假单胞菌生物被膜的形成和结构，特别是在不同菌株之间和临床分离株中。
外膜囊泡(OMVs)，携带各种革兰氏阴性细菌货物，包括次级代谢物、核酸和蛋白质，也被认为是细菌生物被膜基质的重要组成部分（最近在参考文献160中进行了综述）。OMVs的产生受到PQS的促进，并有助于PQS和其他疏水性QS分子的细胞间转移 (161)。2006年，Schooling和Beveridge首先使用多种生物被膜模型（包括琼脂菌落、流动池生物被膜和DFR）证明了OMVs存在于铜绿假单胞菌生物被膜基质中 (162)。自那时以来，铜绿假单胞菌OMVs已被证明根据OMVs的来源促进生物被膜的形成或分散 (163–165)。其中一项研究表明PQS以一种独立于其QS活性的方式促进OMV介导的生物被膜分散 (164)。几项研究进一步表明，铜绿假单胞菌OMVs的货物根据产生OMVs的细胞的生长条件而变化 (162, 165)。因此，PrrF小RNA可能通过其对PQS产生的积极影响来影响低铁条件下OMVs的产生和生物被膜结构 (118, 120)。
**基于铁的治疗策略**
由于铜绿假单胞菌在生物被膜形成和感染过程中需要铁，破坏铜绿假单胞菌铁稳态长期以来一直是开发新型抗微生物药物的策略。在一个例子中，两种FDA批准的Fe(III)螯合剂——去铁胺和地拉罗司——增强了氨基糖苷类抗生素妥布霉素清除CF细胞系上铜绿假单胞菌生物被膜的能力 (54)。妥布霉素通常给予CF患者以帮助控制铜绿假单胞菌定植，但其有效性随着慢性含生物被膜感染的恶化而降低 (166, 167)。研究人员实验室自己的研究进一步证明了PVD铁载体生产的丧失如何增强妥布霉素对在琼脂板上形成菌落或在微量滴定板中生长的铜绿假单胞菌生物被膜的有效性 (143)。这些研究提供了原理证明，即破坏铁稳态可以延长当前抗微生物疗法的有效性。
与这些研究一致，许多研究人员致力于开发一种“特洛伊木马”抗生素，该抗生素与铁载体功能基团缀合，允许抗生素通过铁载体受体被摄取并克服细胞渗透性问题 (168)。其中一种抗生素头孢地尔，于2019年被批准用于治疗由包括铜绿假单胞菌在内的革兰氏阴性细菌引起的复杂尿路感染 (169)，以及对标准疗法难治的医院获得性和呼吸机相关性肺炎 (169)。头孢地尔在这些情况下仍作为最后的治疗选择，这是因为在CREDIBLE-CR试验中报告的不良结局，其中在使用它的部分患者中发病率增加 (170)。这部分归因于对头孢菌素的异质性耐药，即临床菌株群体中的一部分对抗生素表现出耐药性，这在临床实验室中不易检测 (171)。头孢地尔也不太可能用于治疗CF气道感染，因为非铁载体铁获取策略在这些个体中变得更突出（见下文）(102, 103)。尽管如此，头孢地尔提供了一个针对铜绿假单胞菌铁稳态的治疗策略可能广泛成功的例子。临床前阶段的其他策略包括靶向使用血红素作为铁源所需的血红素加氧酶 (113, 172, 173)，以及阻断铁从细菌铁蛋白（代表铜绿假单胞菌中主要的铁储存蛋白）的动员 (174)。
研究人员还研究了镓治疗的效果，因为其与铁的化学性质相似，包括可比的离子半径、电子亲和力、电负性和配位数。镓-68（
68Ga）被FDA批准用作正电子发射断层扫描(PET)扫描期间的放射性示踪剂，硝酸镓(GaNO
3，商品名Ganite)是FDA批准用于治疗高钙血症的药物。先前的工作表明硝酸镓破坏铜绿假单胞菌的铁代谢并抑制生物被膜形成 (175)。进一步研究了不同含镓化合物的抗微生物活性，例如硝酸镓 (175, 176) 和麦芽酚镓 (177)，以及血红素类似物镓-原卟啉 (178) 和镓-水杨醛亚胺 (172)。Ganite先前在一项针对CF患者(pwCF)中铜绿假单胞菌有效性的2期临床试验中进行了研究 (NCT02354859)，一项正在进行的2期试验正在研究这种治疗在定植有非结核分枝杆菌(NTM)的pwCF患者中的效果 (NCT04294043)，突出了这些疗法在CF肺部慢性铜绿假单胞菌感染中的潜在疗效。
此外，最近的研究也着眼于利用宿主营养免疫蛋白作为新型疗法。一个例子是使用Fe(II)螯合剂钙卫蛋白治疗铜绿假单胞菌生物被膜 (179, 180)。钙卫蛋白单独使用已被证明在小鼠伤口模型中抑制铜绿假单胞菌生长 (65)，并在与当前抗生素（如环丙沙星）联合使用时增强生物被膜清除 (180)。另一个例子是使用Fe(III)螯合剂乳铁蛋白，它已被证明通过触发细菌运动来抑制铜绿假单胞菌生物被膜的生长。当乳铁蛋白与稀有糖醇木糖醇结合使用时，铜绿假单胞菌响应乳铁蛋白介导的铁螯合所诱导损伤的能力受到抑制 (181)。此外，一种新型乳铁蛋白缀合镓复合物已被开发出来，并已被证明对铜绿假单胞菌生物被膜具有抗微生物活性 (182)。随着研究人员对铁稳态如何影响生物被膜生长的理解加深，将会有更多关注开发以铁为中心的疗法。
**未来的研究方向**
铜绿假单胞菌的生物被膜感染是公共卫生的重要贡献者，并且铁稳态已被确立为这种病原体感染性和生物被膜形成的中心介质。在过去的25年里，已经确立了铁在铜绿假单胞菌生物被膜生理学中的许多趋同作用，本文对此进行了概述。该领域未来的研究应不仅针对更深入地理解本综述所描述现象的机制，还针对增加这些发现的临床相关性。虽然哺乳动物模型是识别和验证潜在药物靶点的宝贵工具，但能够纳入临床相关环境变量的稳健体外模型对于定义可以导致药物开发的机制是不可或缺的。研究人员提议将以下方向作为将当前的铁和生物被膜研究与临床联系起来的关键下一步。
*温度依赖性铁稳态*
温度是许多病原体毒力基因调控的关键因素；然而，关于温度如何影响铜绿假单胞菌基因调控的研究有限 (101, 183)。铜绿假单胞菌是唯一经过充分研究的假单胞菌，它既能在体温下生长，又能引起感染，这表明在37°C下生长是进化成机会性病原体的一个步骤。两项独立研究表明，铜绿假单胞菌在22°C与37°C下生长时，其转录组发生显著变化，包括在37°C时从PVD到PCH铁载体基因表达的转变，表明铁稳态在适应体温中起关键作用 (101, 183)。额外的研究表明，温度改变了铜绿假单胞菌噬菌体基因的表达，以及铜绿假单胞菌生物被膜中的基质组成 (184, 185)。温度在不同感染环境中有所不同，伤口感染温度约为33°C，而血液和器官感染发生在37°C。此外，环境或室温（25°C）与临床环境中的铜绿假单胞菌储存库高度相关，这些储存库导致医院获得性感染。因此，理解温度如何影响铜绿假单胞菌生物被膜中铁稳态的分子基础，对于开发新的感染控制和治疗策略至关重要。
*临床分离株的适应性*
虽然实验室菌株提供了强大的遗传分析工具，但铜绿假单胞菌的临床分离株很容易适应宿主环境。此外，铜绿假单胞菌的基因组表现出高度可塑性，实验室适应菌株在不同研究小组之间存在差异 (186–188)。因此，评估低传代次数的临床分离株以确定实验室菌株发现的相关性至关重要。有多种资源可用于获得此类分离株，例如西雅图儿童医院的CF分离株核心库，其中保存了来自CF儿童和成人数十年来的铜绿假单胞菌和其他病原体的临床分离株。考虑临床进展对早期研究的铜绿假单胞菌临床分离株相关的基础病理的影响也很重要。例如，CFTR调节剂疗法和改进的抗微生物药物方案已大大减少了CF患者(pwCF)的肺部疾病，导致CF肺部感染的病因发生显著转变 (189–191)。
*多微生物相互作用*
慢性生物被膜感染通常具有多微生物性质，种间相互作用可以显著改变每个定植生物体的生理和毒力能力 (49, 51, 76, 91, 92, 192–195)。例如，金黄色葡萄球菌的存在增强了毒力因子的产生，包括铜绿假单胞菌的AQs (91)。此外，研究人员自己的工作表明，铁限制通过增强AQs的产生来增强铜绿假单胞菌对金黄色葡萄球菌的杀伤 (87, 88)，而先前的工作表明杀伤金黄色葡萄球菌为铜绿假单胞菌提供了一种铁源 (196)。铜绿假单胞菌铁载体也与铜绿假单胞菌在生物被膜中竞争其他微生物的能力有关 (197)。奇怪的是，在铜绿假单胞菌/金黄色葡萄球菌共培养中引入钙卫蛋白会导致铜绿假单胞菌AQs产生减少和共培养期间金黄色葡萄球菌存活率增加 (65)，尽管这种先天免疫蛋白能够在两种生物体中引发铁饥饿反应 (107, 109)。然而，研究人员最近的合作工作发现，钙卫蛋白对铜绿假单胞菌/金黄色葡萄球菌共培养动态的影响是通过一种独特的金属非依赖性方式发生的，包括CP处理的铜绿假单胞菌AQs产生减少 (110, 198)。金黄色葡萄球菌还被证明可以修饰和灭活PCH，并且缺乏这种酶活性的金黄色葡萄球菌突变体在小鼠伤口感染模型中竞争力较弱 (199, 200)。最近的工作通过在含有粘蛋白的人工痰液培养基中培养铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、血链球菌和产黑色素普雷沃菌的混合培养物，开发了一种代表性的CF肺部感染多微生物模型 (192, 201)。使用该模型的初步工作表明，LasR的缺失（这在CF分离株中很常见）(127) 导致铜绿假单胞菌在这些混合群落中对妥布霉素的耐受性增加 (192)。随后使用该模型的研究揭示了代谢交叉喂养，其中铜绿假单胞菌对短链脂肪酸的代谢支持了产黑色素普雷沃菌的生长，后者在单培养时无法在培养基中生存 (201)。理解这些种间相互作用如何影响此类群落中每个生物体的铁稳态途径对于确定当前已发表工作的临床相关性至关重要。
*营养免疫因子的作用*
研究微生物病原体中铁稳态的基础是这种营养素在宿主-病原体相互作用中的核心作用。然而，在实验室培养基中重现宿主环境的金属限制在技术上可能具有挑战性。一个问题是在体外系统中引入宿主相关因子，例如粘蛋白，因为这些因子通常被金属污染，可能使金属稳态研究复杂化。这个问题可以通过引入宿主相关的铁螯合因子（如乳铁蛋白和钙卫蛋白）来克服。事实上，导致本综述所述工作主体的初始研究使用乳铁蛋白证明了铁在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的重要性 (19)。另一个问题是铜绿假单胞菌和其他相关病原体在某些临床相关条件下是否能在没有铁和其他过渡金属补充的情况下生存，因为这可能妨碍仔细的金属调控研究。在研究人员最近的工作中，发现铜绿假单胞菌在没有铁补充的情况下无法进行厌氧生长；然而，研究人员能够通过用CP处理厌氧培养物来重现铁饥饿效应，揭示了氧气对铜绿假单胞菌铁稳态途径的重大影响 (14)。使用CP的进一步研究进一步揭示了这种重要先天免疫因子的独立于金属螯合的作用 (65, 108, 110, 202)，为研究铜绿假单胞菌在慢性生物被膜感染期间如何与宿主和共定植病原体相互作用提供了新的方向。
**总结**
铁稳态是铜绿假单胞菌生物被膜生理学和致病性的核心决定因素。在过去的二十五年里，研究揭示了铁的可用性如何影响铜绿假单胞菌的调控网络、胞外聚合物组成以及与宿主免疫和共感染生物的相互作用。展望未来，研究应优先进一步开发临床相关模型，以将铜绿假单胞菌铁稳态途径的机制发现与患者结局联系起来。这些努力将有助于指导开发以铁为中心的治疗策略，用于治疗涉及铜绿假单胞菌的慢性生物被膜感染。
