整合膜蛋白至少占每个蛋白质组的四分之一。为正确折叠并发挥功能，这些蛋白必须以正确的拓扑和方向插入特定膜中。尽管其跨膜螺旋在化学上与脂双层相容，但细胞内的插入并非简单的自发事件，必须在拥挤环境中于正确膜上发生，且常面临将亲水区段跨膜转移或容纳与膜仅勉强相容的螺旋等挑战。因此，细胞依赖专用系统引导膜蛋白至膜、介导其插入，并对该过程进行监控以确保准确性。本综述阐述了细胞内膜蛋白插入的基本原理，解释了跨膜序列特征如何与介导其进入双层的机器相互作用。研究人员重点介绍了细菌和真核生物的主要插入系统及其辅助因子，描述了这些通路如何适配细胞中从单次跨膜蛋白到复杂多跨膜转运体的多样膜蛋白结构。此外，还讨论了当插入失败时细胞如何通过检测和纠正错误插入的机制维持准确性。综上，这些概念将膜蛋白插入呈现为一个由序列特性、膜环境与负责构建膜蛋白质组的机器共同塑造的协调、可适应且受保护的过程。
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引言
膜蛋白（MPs）参与信号转导、代谢、营养与离子转运、催化等多种必需细胞过程，每分钟有数千至数万个膜蛋白在各活细胞中合成。功能性膜蛋白需抵达正确膜定位、插入膜中、折叠为精确三维结构并与适配蛋白组装。尽管各步骤在热力学上均有利且理论上可自发发生，但在细胞中这些过程易出错，因此受到精密分子机器的严格介导与监控。本综述聚焦于所有整合膜蛋白必经的核心步骤——膜插入，主要针对占膜蛋白绝大多数的α螺旋膜蛋白，β桶状膜蛋白因采用不同机制插入，在本期专刊另一篇综述中单独讨论。膜插入不仅是膜蛋白锚定于正确细胞位置的基础，也为其折叠提供必需的物理化学环境：插入过程诱导跨膜螺旋（TMs）形成α螺旋构象并大致垂直于膜平面排列，这是跨膜螺旋三维堆积形成功能性折叠的起点，同时受脂双层性质调控。从纯化学角度看，插入似乎简单，因为疏水跨膜区在膜中更稳定；但在细胞中，这是一个受多种因素调控的复杂过程，与遗传疾病机制和膜蛋白进化密切相关。本综述旨在关联膜蛋白插入的化学、生物化学与细胞生物学层面，阐释介导和监控这一关键步骤的细胞系统的内在逻辑。
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膜插入的化学：化学规则与细胞现实
特定多肽区段是否作为跨膜螺旋插入膜，主要取决于热力学：该区段驻留于膜中相较于驻留于胞质水溶液或膜界面中间环境的能量优势。插入驱动力源于跨膜区段与膜疏水核心的化学互补性。跨膜螺旋通常由约20个氨基酸组成的疏水区段构成，折叠为α螺旋时长度恰好跨越脂双层约30 Å的疏水核心。膜内极性基团（无论主链还是侧链）在能量上不利，因为膜无法为主链氢键或离子相互作用提供亲水伙伴；α螺旋构象通过内部满足主链氢键潜力，同时将疏水侧链暴露于脂质环境以实现有利相互作用，解决了这一问题。
脂双层并非均一环境，与脂质头基共同构成约40–45 Å厚度，存在陡峭的极性梯度：从表面的亲水头基到高度疏水的核心。跨膜序列常通过梯度匹配优化膜相容性：例如跨膜区中心的疏水残基比边缘残基对插入的贡献更强。除疏水性这一主导决定因素外，其他序列特征也调控插入：芳香族残基常在膜界面富集，形成与脂质头基相互作用的“芳香带”；脯氨酸虽疏水，但可破坏螺旋性并降低插入效率；带正电残基行为更复杂，可通过“snorkeling”将其带电基团朝向水相，并通过“正电荷内侧规则”决定跨膜取向——该规则指跨膜螺旋倾向于使 flank 正电荷更多的一侧面向胞质而非膜外侧。不同体系已量化单个氨基酸对膜插入的贡献，发展出“疏水性标尺”，这些标尺虽基于不同实验计算方法与膜环境，结果却高度一致，反映了各残基与膜物理化学梯度的匹配程度，广泛用于预测跨膜螺旋位置，对膜蛋白质组中约80%的跨膜螺旋识别准确，结合额外信息的新方法可进一步提升准确性。
但在活细胞中，情况更复杂。正确膜插入需与多个过程竞争，多个失败点可导致错误插入。首先，真核细胞含多种不同膜，每种膜蛋白必须插入其正确靶点，错误靶向会损害适合度或引发毒性；不同膜的脂质组成差异及其生物物理性质对插入的影响尚不明确，例如紧密排列的脂质尾可能阻碍自发插入，而松散排列的头基可能促进插入，但这类脂质相关现象如何在不同细胞膜中调控插入仍不清楚。其次，膜蛋白的跨膜区段与膜的相容性差异很大：许多跨膜区与双层高度匹配，但也有例外——尤其是多跨膜蛋白中，跨膜区常含极性或带电残基，或短于膜疏水核心；在折叠蛋白中，这些特征通常被埋入蛋白内部而避开脂质环境，但在插入阶段（折叠尚未完成），这些跨膜区处于亚 optimal 状态。即使条件更有利，跨膜插入仍需应对其他细胞挑战：促进插入的跨膜疏水性也使这些区段在水溶液胞质中易聚集，为避免聚集与错误折叠，跨膜区必须快速高效插入。此外，膜蛋白结构本身带来额外障碍：跨膜区两侧通常 flank 亲水区段（连接相邻跨膜区的环或末端尾区），最终位于膜外侧（非胞质侧）的环与尾需在插入过程中跨膜；短且无电荷的外侧环或尾可能被动扩散跨膜，但多数因亲水性过强，无法在无辅助的生物相关时间尺度内完成跨膜。因此，尽管自发插入在体外（干扰过程更少）可被观察到，但在细胞中效率低且易出错。细胞通过专用机器协调、加速并校对插入过程，确保功能性正确折叠的膜蛋白质组形成。
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膜蛋白生物发生工具包：靶向与插入的细胞机器
3.1 膜蛋白靶向至目的地膜
大多数膜蛋白由胞质核糖体合成，必须在插入前抵达正确膜。体外实验中，跨膜区疏水性足以自发结合膜，但在拥挤胞质中，跨膜区可能在抵达目的地前发生聚集；真核细胞中这一挑战更突出，因存在多个膜结合细胞器，若无专用引导，膜蛋白可能错误定位到错误膜，导致错误折叠、功能丧失、降解或毒性效应。
细胞依赖专用靶向通路克服这些障碍。靶向信号分为两类：非切割元件（成熟蛋白的一部分，通常为跨膜区及其 flank 区域）和可切割信号（如蛋白N端的疏水信号肽，靶向后迅速切除，成熟蛋白中无痕迹）。靶向通路末端，客户蛋白被移交至膜插入机器（通常为转运体或插入酶），由其介导插入脂双层。真核细胞中多条通路共存以服务不同细胞器；即使是仅含单层胞质面膜的细菌，也至少有两条并行通路将不同类别的膜蛋白与分泌蛋白客户靶向至质膜。最经典的靶向通路是信号识别颗粒（SRP）系统，从细菌到人类高度保守：SRP在翻译过程中扫描核糖体，结合最早从核糖体出现的N端跨膜区或可切割信号肽，随后通过膜结合SRP受体将携带这些信号的核糖体-新生链复合物靶向至膜上的SRP受体，再移交至插入机器（如真核内质网（ER）或细菌质膜的Sec转运体）。SRP通过双重方式防止聚集：屏蔽疏水跨膜区免于水环境暴露，并确保后续跨膜区在插入机器旁合成，实现跨膜区的共翻译插入——多数合成膜蛋白的核糖体已靶向并停靠在转运体上，使跨膜区一出现即可插入，最小化胞质暴露。
但并非所有客户都能使用共翻译通路。例如尾锚定（TA）蛋白含单个C端跨膜区，合成过晚以至于SRP无法结合核糖体：因跨膜区靠近蛋白C端，仅在翻译完成后才从核糖体出现，此前埋在核糖体出口隧道（容纳约30–40个氨基酸，无法有效结合SRP）中，待疏水跨膜区完全暴露时，蛋白已从核糖体解离，无法进行共翻译靶向，需进行翻译后靶向。细菌中SRP也可翻译后作用；真核细胞中则演化出专用通路，包括GET和EMC通路，疏水尾锚在胞质中被分子伴侣护送至膜插入酶。SRP也无法靶向线粒体、叶绿体或过氧化物酶体蛋白，这些细胞器依赖替代通路，部分为共翻译、部分为翻译后。例如线粒体大部分蛋白从胞质输入，依赖多条针对不同蛋白类别的通路：外膜蛋白根据拓扑结合不同胞质分子伴侣与靶向因子，随后通过专用插入机器插入外膜；内膜蛋白通常带N端前序列，经TOM复合物穿过外膜，再通过TIM23、TIM22和Oxa1插入酶插入内膜；还有一部分内膜蛋白由线粒体内核糖体合成，经Oxa1插入酶共翻译插入。靶向特异性的实现源于跨膜区及flank区域的细微序列差异，被靶向与插入机器识别解读；通路的每个组分（初始识别、分子伴侣护送、膜递送步骤）均可作为选择性过滤器，胞质中靶向因子相互竞争，客户序列或暴露时间的微小差异可改变亲和力与捕获效率的平衡，偏向某一通路。部分通路存在重叠（尤其在ER中），这种冗余提供了稳健性，允许替代通路备份；插入机器也可能通过拒绝不相容客户贡献特异性，例如ER驻留的EMC无法高效处理线粒体尾锚定蛋白，部分原因是其带正电的flank残基。单一通路无法保证完美保真度，但其组合与胞质分子伴侣、细胞器特异性插入酶共同提供稳健分选；若存在错误靶向，监控系统可降解或重定向错误定位的蛋白。
3.2 核心插入机器：转运体与插入酶
靶向至正确膜后，客户膜蛋白的跨膜区通过专用机器插入。这些系统演化出从靶向通路或核糖体捕获跨膜区、将其插入双层、并以精确且动力学高效的方式将flank亲水环或尾跨膜转移的能力。两类最明确的机器属于两个普遍存在的家族：Sec转运体和Oxa1家族插入酶。Sec转运体含蛋白传导孔，Oxa1家族插入酶形成膜嵌入的亲水沟槽，仅能在插入过程中跨膜转移底物的短极性区域。Sec转运体和Oxa1家族插入酶处理原核细胞细胞膜与真核细胞ER这两个膜蛋白插入的主要位点的跨膜区；其他细胞器（线粒体、过氧化物酶体、叶绿体）的插入机器在本期专刊其他综述中单独讨论，此处聚焦Sec转运体与Oxa1家族插入酶。
3.2.1 Sec转运体
Sec转运体是研究最深入的插入系统，40多年前首次鉴定，现通过结构与生化方法得到广泛表征。细菌中为SecY、SecE、SecG组成的SecYEG复合物，真核同源Sec61复合物由Sec61α、Sec61γ、Sec61β组成；两个小亚基（SecE/G或Sec61γ/β）位于外周，稳定组装，而含10个跨膜区的SecY/Sec61α提供中心通道。Sec转运体通常在膜蛋白生物发生中执行共翻译插入，将跨膜区直接从核糖体插入膜中，也可翻译后发挥作用（最明确的是针对可溶性分泌前体）。其功能由三个结构特征定义：第一，SecY/Sec61α的胞质环与核糖体出口隧道对接，使新生链可直接从核糖体出口隧道进入转运体，最小化胞质暴露，核糖体与通道间的小间隙允许膜蛋白的胞质环从胞质伸出。第二，SecY/Sec61α含蛋白传导通道——贯穿膜从胞质到膜外侧的沙漏形孔道，可跨膜转运任何未折叠多肽，甚至非常亲水或长的序列，介导大部分大亲水域的分泌（无论是膜蛋白的外侧环还是整个分泌蛋白），静止状态和多肽转运过程中，小塞与孔环残基密封渗透屏障。第三，侧向门是跨膜插入的主要位点，位于SecY/Sec61α的假对称半部之间，形成蛤壳样结构；为允许疏水序列插入双层，蛤壳两半可分离，形成向膜外侧打开的门，使SecY/Sec61α孔暴露于磷脂双层以实现插入。主流的“侧向门”插入模型（主要基于单跨膜区和信号肽底物建立）仍是Sec介导插入的共识观点：疏水信号肽或跨膜区结合诱导门打开，使跨膜区以跨膜构型整合于侧向门；同时塞被置换，允许亲水环通过Sec孔转运，而额外跨膜区可通过侧向门侧向分配到双层中。
3.2.2 Oxa1家族插入酶
第二类插入系统是Oxa1家族插入酶，首先在线粒体中发现（Oxa1及其同源物Oxa2/Cox18），还包括叶绿体插入酶Alb3和Alb4、细菌成员YidC，均介导膜蛋白插入，可共翻译或翻译后作用。细菌插入酶YidC是研究最充分的例子，可独立或与Sec转运体复合物协同介导跨膜插入。YidC含主要由带正电胞质环和C端形成的核糖体结合位点，也可在核糖体外捕获跨膜区；其第一个环的胞质卷曲螺旋有助于底物捕获，确保疏水区段从核糖体或SRP移交至膜。与Sec不同，YidC保守的跨膜核心不形成贯穿双层的连续通道，而是形成一个延伸至膜一半深度的浅亲水沟槽，可容纳客户蛋白跨膜区flank的短亲水区段以促进其转运，同时相邻疏水表面引导跨膜区段进入脂质相；分子模拟与半胱氨酸扫描研究进一步表明YidC诱导局部膜变薄，有效降低极性基团跨膜的能垒。沟槽与膜变薄共同为插入带短极性flank区域的螺旋创造有利环境，但缺乏孔道限制了底物范围：插入酶无法转运长亲水环或结构域，这是其与Sec转运体的功能区别。
真核ER含三个Oxa1家族的远缘同源物：Get1/WRB、EMC3和TMCO1。与单亚基的YidC不同，ER同源物的插入酶结构拆分到两个相互作用的蛋白中：Get1/WRB、EMC3和TMCO1提供类似YidC的3个跨膜区保守核心，而Get2/CAML、EMC6和OPT1（C20orf24）与之结合以完成并稳定功能性插入酶单元。所有同源物均保留核心架构：3个跨膜区插入酶、胞质卷曲螺旋、与局部膜变薄协同作用的亲水沟槽。扩大的真核插入酶 repertoire 可能反映区室化细胞中需适配更广底物范围并满足更强质量控制需求的演化压力：ER中GET复合物（Get1/WRB与Get2/CAML）插入尾锚定蛋白；TMCO1/OPT1构成后生动物特有的GEL复合物，近期被认为参与多跨膜膜蛋白插入；EMC3/6构成更大的EMC复合物的核心（酵母8个亚基、人类9个亚基），处理部分尾锚定与多跨膜膜蛋白，已成为膜蛋白生物发生的核心枢纽，结合跨膜插入酶核心与参与客户识别、脂质重塑的多个外周模块，这些功能才刚被阐明。
3.2.3 转运体与插入酶的功能相似性
尽管结构与机制不同，Sec转运体与Oxa1家族插入酶存在一些功能相似性。信号肽或信号锚在侧向门初始结合（早于孔完全打开）在概念上与Oxa1家族插入酶功能相似。此外，这两类作为膜中最早接触新生跨膜区的机器，可作为膜内分子伴侣稳定不稳定螺旋，直至蛋白完全插入并折叠——尤其亲水跨膜区常与Sec转运体结合，直至插入后期或其他结构域到来促进折叠；近期冷冻电镜结构显示SecA稳定的SecY复合物插入多跨膜膜蛋白时，在膜两侧均具有类分子伴侣作用，胞质侧促进去折叠、胞外侧促进折叠。多条证据表明Oxa1家族插入酶共享这一分子伴侣功能：例如细菌YidC可独立于插入协助LacY和MelB等膜蛋白折叠；ER中EMC作为膜内分子伴侣，可在错误折叠蛋白走向折叠或亚基组装过程中瞬时结合，尤其亲水跨膜区在这些客户蛋白中富集，其与周围双层的错配可能阻止自由扩散，解释了这些跨膜区为何持续结合插入机器。
插入系统的另一个新兴共有特征是与脂质重塑的联系。Oxa1家族插入酶诱导的膜变薄让人联想到脂质scramblases——利用浅亲水沟槽促进脂质在双层小叶间移动；近期研究表明插入酶自身可能具有脂质scrambling活性，Sec61也被推测具有类似活性。由于SecY也被证明可局部变薄双层，脂质scrambling可能是插入机器的普遍原理：瞬时软化双层以允许极性残基通过，同时引导疏水螺旋进入膜。
3.3 插入机器的辅助伙伴
细胞蛋白插入与转运机器处理极多样的分泌蛋白与膜蛋白，为高效适配这一庞大底物库，转运体与插入酶可协同作用，并利用动态辅助蛋白与蛋白复合物网络。这些因子在原核与真核生物中各异，但执行相似功能：协助跨膜插入、外侧环转运，以及对膜内外未成熟的蛋白区段进行分子伴侣护送。
3.3.1 细菌辅助因子
细菌中该网络以SecYEG转运体为核心，仅少数底物可仅靠YidC插入。SecYEG可存在于与YidC、必需ATP酶SecA、辅助SecDF复合物（大肠杆菌中还含YajC蛋白）的复合物中，或作为包含SecDF(YajC)和YidC的全转运体（holotranslocon）的一部分。SecA是与细菌转运体相关的最经典辅助因子，是一种胞质ATP酶，驱动大亲水区段（通常为分泌蛋白或膜蛋白的周质环）跨膜转运；SecA主要通过翻译后途径作用于带可切割信号肽的分泌蛋白，在靶向与转运中发挥双重作用：识别信号肽，将前体递送至SecYEG通道，随后利用ATP水解驱动构象循环，打开通道并将底物推过膜，该活性还受质子动力势增强。尽管以翻译后分泌最为人知，SecA也可共翻译作用：与翻译带高疏水性信号肽的分泌蛋白的核糖体-新生链复合物结合，以及与某些含大外侧（周质）环的整合膜蛋白结合，在这些情况下，SecA可能协助SecYEG通道在翻译进行时牵引延伸的多肽区段跨膜。SecDF是另一辅助复合物，功能较不明确：SecA从胞质侧协助底物通过SecYEG，而SecDF复合物可能从周质侧协助，基于结构与功能数据的模型认为SecDF结合从SecYEG出现的底物，并将质子转运与大构象变化偶联以牵拉底物通过。SecYEG也与YidC插入酶协同，既作为异四聚体复合物，也作为全转运体的一部分；这些含YidC复合物的相对丰度、底物库与作用尚未完全解析，YidC被认为协助SecYEG插入多跨膜蛋白、组装膜寡聚复合物，并作为折叠分子伴侣。最后，全转运体复合物与BAM复合物（β桶装配机器）及Skp、SurA、YfgM-PpiM复合物等周质分子伴侣的相互作用，对外膜蛋白生物发生至关重要，不在本综述范围内。
3.3.2 真核辅助复合物
真核生物中底物与膜区室的多样性反映在ER插入与转运机器的复杂性上。核心Sec61转运体在一个蛋白复合物网络中运作：部分复合物（如Sec62/63或TRAP复合物）通过打开或稳定Sec转运体的侧向门或孔协助蛋白插入与转运；其他如“多跨膜转运体”（MPT）复合物BOS（Sec61背面）、GEL（GET-和EMC样）和PAT（与转运体相关蛋白）与Sec转运体协同，实现多跨膜蛋白的高效插入；转运体还与修饰酶（如寡糖基转移酶复合物OST，可通过给腔侧环添加大亲水基团稳定蛋白拓扑；信号肽酶复合物，切割信号肽）结合。尽管机制细节尚不完全清楚，但不同底物的高效插入被认为需要这一复杂辅助网络的不同子集：例如Sec62/63复合物主要参与分泌蛋白的翻译后转运，而异四聚体TRAP复合物存在于90%以上的后生动物ER核糖体-转运体复合物中，两者均被认为协助“困难”底物的插入与转运。TRAP被认为通过稳定开放的Sec61构象，协助含信号肽的前体与侧向门控活性较弱的多跨膜蛋白的转运，还在胞质侧与核糖体相互作用、在腔侧与OST复合物相互作用，增强部分蛋白的N-糖基化。Sec62/63复合物（酵母中还包括非必需亚基Sec71/72）被证明可打开侧向门，帮助通道处理疏水性较低的信号肽或跨膜区；Sec63通过其J结构域招募并激活腔侧HSP70家族分子伴侣BiP（酵母中为Kar2），与细菌SecA类似，BiP利用ATP增强跨膜转运，但不同于SecA从胞质侧推多肽链，BiP以ATP依赖方式结合ER腔中出现的多肽，作为分子棘轮阻止其滑回胞质，此外BiP结合Sec61α的腔侧环可限制ER Ca2+通过孔的泄漏。其他特征较少的辅助因子包括TRAM1（转运链相关膜蛋白）、RAMP4（核糖体相关膜蛋白4，哺乳动物中为SERP1，酵母中为Ysy6）和后生动物特有的脯氨酰异构酶FKBP11：TRAM1在信号肽与跨膜区转运过程中与它们交联，其耗竭影响部分信号肽的体外转运效率并降低体内多种分泌与膜蛋白的表达；RAMP4在新生链通过Sec61转运过程中与其交联，近期被鉴定为核糖体-转运体复合物的常见组分，基于结构细节被认为充当替代信号肽，在特定序列的后期转运阶段促进其通过Sec61通道；FKBP11是ER定位的脯氨酰异构酶，也是该家族唯一含跨膜区的成员，被证明在分泌与膜蛋白翻译过程中结合核糖体-转运体复合物，偏好第一个转运区段较长的蛋白，FKBP11耗竭会导致这类底物不稳定，提示其作为转运体辅助因子的作用，但是否需要脯氨酰异构酶活性仍未知。
近期鉴定的专用核糖体-转运体组装体MPT含三个额外复合物：BOS、GEL和PAT，结合在Sec61背面，形成一个动态模块化复合物，介导多跨膜膜蛋白的插入。部分核糖体-Sec61复合物组装为MPT，其他多数组装为“分泌型转运体”，含Sec61、TRAP和寡糖基转移酶复合物A（OSTA）；分泌型转运体利用开放的Sec61孔转运长分泌区段或大外侧环，而MPT复合物围绕关闭的Sec61通道构建，介导由短转运环连接的跨膜区的整合。这两种架构被认为是核糖体-Sec61组装的互斥状态，针对不同
