灰霉病作物病害真菌孢子检测：用于实时监测灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的印迹聚合物热测传感平台

在食品生产链中，及时识别病原体对于防止腐败并降低与作物损失相关的重大经济负担至关重要。灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是灰霉病的致病因子，可侵染番茄等重要作物。本研究提出了一种用于该真菌实时监测的传感平台。该传感器由一种聚合物受体构成，所述受体对该真菌孢子的物理与化学特征进行印迹，从而实现识别。检测通过热传感换能器完成，其对分析物表现出具有良好重复性的、依赖浓度的信号。研究人员以其他孢子〔附白轮枝菌（Ampelomyces quisqualis）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和Akanthomyces muscarius〕测试了该传感器的特异性，结果显示其对目标微生物的响应强度显著更高。研究人员进一步采用采自番茄栽培温室、含有B. cinerea的水样评估该传感器的实际应用性。上述结果凸显了该平台作为该植物病原体常规监测工具的潜力。

该文发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》，围绕农业生产中灰霉病病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）早期监测这一现实需求，构建了一种基于表面印迹聚合物与热传递法（HTM，Heat-Transfer Method）的仿生传感平台，用于真菌孢子的直接、实时检测。研究背景在于，真菌导致的作物腐败会造成显著的产量损失与经济负担，其中B. cinerea是葡萄、草莓、番茄等多种经济作物中最具破坏性的病原之一。该病原能够侵染花、果、叶等多种组织，并可经空气、土壤和水传播；在高湿、低温的温室环境中，其暴发风险尤其突出。现有防控策略主要依赖化学和生物制剂，但病原抗药性增强正削弱其效果，因此，建立能够在可见病症出现前完成预警的快速检测技术，具有重要应用价值。

目前，真菌感染识别主要依靠组织颜色变化、枯萎和腐烂等表观症状，但此时病程常已进展。分子诊断、平板培养与显微镜计数虽然可用于孢子定量与鉴定，但往往成本较高，且依赖专业设施和技术人员。相较之下，印迹聚合物传感器具有仿生识别、材料稳健、适于复杂理化条件等优势，但既往研究主要集中于小分子或细菌对象，针对真菌病原特别是较大尺寸孢子的印迹识别仍十分有限。原因在于微生物印迹制备面临多重难点，包括模板需在温和条件下保持完整、模板去除困难以及再结合过程受限等。因此，本研究的意义在于将表面印迹策略推进至真菌病原孢子层面，并通过热学换能实现低成本、可移植的检测方案。

为实现上述目标，研究人员构建了由聚二甲基硅氧烷（PDMS，polydimethylsiloxane）与氧化石墨烯粉末（GOx，graphene oxide powder）组成的复合受体层。其核心设计是利用半固化PDMS膜表面的沉降印迹，使B. cinerea孢子在重力作用下沉积于材料表面，随后经后固化使聚合物获得与孢子形貌、尺寸及部分表面化学特征相匹配的识别空穴。为解决真菌孢子模板难以通过常规洗脱方式去除的问题，研究人员提出了干态“反向印章”（counter-stamping）机械去模板方法，即采用裸PDMS印章反复贴附并剥离印迹表面，从而将嵌入膜中的孢子机械性带出。这一方案避免了表面活性剂或有机溶剂可能带来的结构破坏与残留问题。最终，研究人员证明该平台能够对目标孢子产生浓度依赖性的热响应，对非目标真菌孢子的响应显著较低，并且在温室除湿器水样中仍保持可用性能。

主要技术方法可概括如下：研究人员首先培养并收获B. cinerea及3种非目标真菌孢子，以计数室校准浓度；随后制备含0.01% GOx的PDMS复合膜，通过旋涂、半固化、目标孢子沉降与后固化完成表面印迹；采用自定义PDMS反向印章法去除模板，并通过明场显微镜、扫描电子显微镜（SEM，scanning electron microscopy）及ImageJ图像分析评估空穴形成与表面覆盖率；检测阶段将印迹芯片装入微流控热传递装置，记录不同浓度孢子注入后的温度变化；实际样本部分使用番茄温室除湿器采集水样，经重力过滤、高压灭菌后再进行已知浓度加标测试。

以下为论文结果与讨论部分的凝练解读。

3.1. Preparation of Synthetic Receptors for B. cinerea Spores
本节主要说明B. cinerea孢子合成受体层的构建及其表面形貌证据。研究人员采用沉降法将孢子沉积到半固化PDMS膜表面，后续完全固化后，聚合物层记录了孢子的形状和尺寸信息。作者指出，在成模过程中，目标微生物部分嵌入聚合物，模板去除后将形成可供再结合的功能性空穴，这些空穴不仅在几何形貌上与孢子相匹配，也可能保留部分与识别有关的界面特征。明场显微镜与扫描电子显微镜结果证实，在去模板前，膜表面存在明显孢子聚集及少量菌丝；表面覆盖率为23.3% ± 3，提示模板在材料表面具有一定分散性但存在团聚。去模板后，表面出现大量椭圆样空穴，仅有少量孢子残留，残余覆盖率降至4.2% ± 0.5，即约80%的孢子被成功移除。该结果表明，所建立的机械式反向印章法可有效解决真菌孢子模板去除问题，使印迹位点重新暴露并具备再结合能力。研究人员据此证明，该研究提供了一种较为简便的真菌孢子印迹受体制备途径。

3.2. B. cinerea Detection with the Heat-Transfer Method
本节聚焦于热传递法对目标孢子的定量响应。研究人员将印迹PDMS/GOx受体固定于微流控腔室中，以PBS缓冲液建立基线，再按阶梯方式注入B. cinerea孢子悬液，每次浓度增量为200 E3 CFU/mL，并在每次注入后等待20 min以完成信号稳定。实验结果显示，随着目标孢子浓度升高，传感系统记录到逐步降低的温度信号。研究人员将这一现象解释为：当印迹空穴为空时，界面热流传导状态与孢子再结合填充空穴后的状态不同，孢子结合会阻断或扰动局部微尺度热流通道，从而引起热阻变化并表现为温度响应。GOx作为功能性热添加剂被引入PDMS基体，其高内禀热导性可增强受体—液体界面的热传递耦合，使结合事件更易转化为可测信号。通过6次重复构建剂量—反应曲线后，研究人员发现印迹材料的效应值随浓度上升而增加，而非印迹对照材料信号明显较低，说明观测到的响应并非单纯源于孢子在材料表面的沉降，而主要来自对印迹位点的特异性再结合。采用3σ方法计算，平台的检出限为170 E3 CFU/mL。作者同时强调，B. cinerea对作物造成危害不存在统一固定的安全阈值，其风险受接种密度、宿主易感性以及温湿度、气流等环境条件共同影响，因此该检出限主要用于表征传感器当前性能，具体应用场景仍可能需要进一步优化。

3.3. Response of the Receptor Layer toward Other Fungal Spores
本节评估受体层对非目标真菌孢子的选择性。研究人员选择了3种具有现实相关性的孢子进行比较：植物病原尖孢镰刀菌（F. oxysporum），以及常用作生物防治剂的A. muscarius和A. quisqualis。设置这些对象的目的，在于模拟温室或农业生产环境中可能共存的真菌背景。结果表明，在测试浓度范围内，A. muscarius几乎不引起显著响应；F. oxysporum与A. quisqualis仅产生略高于噪声水平的信号。与之相比，B. cinerea在各个浓度下产生的传感信号至少高出2倍，证明印迹受体对目标孢子具有更强的识别能力。作者认为，非目标孢子产生微弱响应可能与两类因素相关：其一是PDMS材料与细胞之间的非特异性相互作用，如静电、疏水或范德华作用；其二是某些非目标孢子在形貌或表面化学功能团层面与空穴存在有限互补性。尽管如此，整体结果仍支持该平台具有针对B. cinerea的相对特异识别特征，也提示后续可通过更精细的校准或数据分析提高多病原区分能力。

3.4. Greenhouse Samples Measurements
本节检验传感器在真实复杂基质中的适用性。研究人员从番茄温室除湿器中采集水样，经滤纸重力过滤去除固体颗粒后，为避免未知病原干扰，先进行高压灭菌，再加入已知浓度B. cinerea孢子进行加标测试。与缓冲液中的实验相比，温室水样中的实时温度曲线呈现相似的浓度依赖性下降趋势，表明传感器的工作机制可以迁移到真实样本基质中。值得注意的是，温室水样信号噪声略高。作者将其归因于样本来源的复杂性：空气循环经除湿器时可能夹带微小粉尘颗粒，冷凝水储存与输送过程也可能引入固体杂质，这些因素都可能附着在孢子表面或干扰温度稳定化过程。然而，在多次重复构建剂量—反应曲线后，温室水样与PBS缓冲液中的响应在各浓度点总体重叠，尽管前者效应值略高，但并未改变平台的可检测性判断。该结果说明，所开发装置在具有一定环境复杂度的农业样本中仍具有良好的可转移性和稳定性。

在综合讨论中，论文将该工作置于近10年B. cinerea生物传感研究稀缺的背景下加以评价。作者指出，现有少量相关传感器多聚焦于DNA、水杨酸或漆酶活性等生物标志物，而非直接对孢子本体进行检测，因此本研究所提出的“孢子直接识别+热学换能”路线具有方法学补充价值。研究的优势包括：采用商业化PDMS构建受体层，制备流程相对简便；利用GOx增强热响应，提高HTM信号可读性；通过机械去模板策略解决真菌孢子印迹中的关键工艺瓶颈；在真实温室水样中验证了平台可行性。与此同时，作者也明确提出其局限性：当前实验仍在受控实验室条件下完成，尚需在真实温室环境中进一步验证；检出限能否满足不同设施场景需求，还需依据具体监测目标调节；现场应用还必须考虑气流、湿度、温度等环境变量对采样与检测过程的影响。未来可能的改进方向包括传感器微型化、远程数据采集集成、温控模块优化，以及与电化学换能器结合或引入采样富集模块以提升灵敏度。

研究结论部分可译为：本研究证明了一种用于检测B. cinerea的仿生传感器具有可行性，即使在采自温室除湿器的水样中也能获得可重复结果。所提出的平台利用简单材料实现了直接检测，同时保持了较快的响应时间。研究结果进一步表明，该传感策略有望拓展至其他真菌污染物的检测，体现出更广泛的适用潜力。总体而言，研究结果凸显了在农业应用中采用仿生印迹聚合物传感器进行真菌早期检测的潜力。从研究层面看，该工作将表面印迹的应用范围拓展至真菌病原体，回应了微生物印迹领域的既有挑战，并推动了面向田间部署的生物传感平台发展。此外，快速检测技术的实施有望支持精准农业（precision agriculture），通过更早干预减少不必要的杀菌剂使用，并促进更可持续的作物保护实践。