CD32b界定骨髓粒细胞巨噬细胞集落刺激因子培养体系中生成的差异化树突状细胞谱系

在体外利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）培养骨髓（BM）是生成小鼠树突状细胞（DCs）最常用的标准方法，尽管这些主要组织相容性复合体II类（MHC II^hi）GM-CSF诱导的树突状细胞（GM-DCs）的发育过程仍然知之甚少。在此，研究人员表征了由骨髓体外生成的GM-DCs包含两个不同的亚群，它们由CD32b的表达来区分，并且产生于不同的时间点，源自不同的祖细胞谱系。单核细胞-树突状细胞祖细胞（MDPs）在骨髓培养的第一周内产生CD32b^- GM-DCs，而粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）以较慢的速率生成CD32b⁺ GM-DCs，并在培养后期成为数量优势群体。此外，在骨髓培养中存在独立的前GM-DC（pre-GM-DC）群体：Ly6C^-CD32b^-MHC II^int pre-GM-DC对应于CD32b^- GM-DCs，而Ly6C^-CD32b⁺MHC II^int pre-GM-DC则对应于CD32b⁺ GM-DCs。这两个GM-DC亚群也表现出不同的功能；具体而言，CD32b⁺ GM-DCs具有增强的刺激CD4⁺ T细胞的能力。值得注意的是，当过继转移到经GM-CSF处理的小鼠体内时，与快速产生异质性GM-DC亚群的MDPs相比，GMPs以延迟的动力学选择性地在体内产生CD32b⁺ GM-DCs。因此，研究人员首次将CD32b鉴定为区分两个发育和功能上不同的GM-DCs的标志物，从而证明了GM-DCs的异质性。

树突状细胞（Dendritic cells，DCs）是专职抗原呈递细胞，通过启动对病原体的T细胞反应连接先天免疫和适应性免疫。DCs根据其发育起源和功能被广泛分为浆细胞样DCs（pDCs）和经典DCs（cDCs）。pDCs来源于共同淋巴样祖细胞（CLPs），专门负责抗病毒反应，其特征是产生I型干扰素。cDCs起源于髓系祖细胞，并进一步分为1型（DC1）和2型（DC2）亚群。DC1s专门负责向CD8⁺ T细胞交叉呈递抗原，并表达IRF8、BATF3和XCR1，而DC2s在激活CD4⁺ T细胞方面更有效，并且在表面标记物和转录程序上表现出更大的异质性。

最近的研究突出了DC2区室内的功能和发育多样性。基于转录因子如RORγt（RORC）和T-bet（TBX21），以及表面标记物如ESAM、CD301b（MGL2）、DC-SIGN（CD209A）和CLEC12A，已经鉴定出不同的DC2亚群。此外，这种异质性通常与包括单核细胞来源的DCs（MoDCs）在内的单核细胞来源的细胞重叠。

继基础性发现——利用GM-CSF培养小鼠骨髓或血液可在体外产生大量DCs——之后，随后的研究证明，在体外用GM-CSF和IL-4培养人单核细胞可产生MoDCs。进一步的研究确立了小鼠单核细胞在体内炎症期间产生MoDCs。值得注意的是，利用GM-CSF和GM-CSF受体敲除小鼠的研究揭示了不同的发育需求：一些报道表明，在炎症期间，MoDCs可以在体内独立于GM-CSF产生；而另一些研究则证明，具有高度免疫原性和致病性的MoDCs严格依赖于GM-CSF信号。这些并行的发现表明存在多种、依赖于环境的MoDC发育途径，因此有必要从个体发育根源上进行更精确的检查。

为研究这些不同的DC群体，通常采用两种主要的培养系统：基于FLT3L的培养体系，它主要模拟稳态cDCs的发育；以及基于GM-CSF的培养体系，被广泛用于模拟炎症性MoDCs。这些体外平台已成为解析经典DC和炎症DC谱系之间复杂关系的重要工具。

髓系祖细胞传统上分为粒细胞-单核细胞祖细胞（GMPs）和单核细胞-树突状细胞祖细胞（MDPs），两者都能产生单核细胞，但具有不同的分化潜能。MDPs被认为是cDCs和巨噬细胞的主要来源，而GMPs主要产生粒细胞和中性粒细胞。然而，新兴证据表明，在特定条件下，GMP来源的单核细胞可能促进DC分化。其中一个群体最近被命名为DC3，据推测它通过一个称为pro-DC3的前体阶段由Ly6C⁺ MDPs产生。DC3亚群在表型上由标记物如CD16/32（FcγrIII/IIb；FCGR3/FCGR2B）、CD172a（SIRPA）和LYZ2定义，但其确切的谱系以及与其他cDCs的关系需要进一步阐明。

用GM-CSF培养小鼠骨髓长期以来被用作在体外约一周内生成CD11b⁺ DCs的标准模型。历史上，定义DC状态的概念框架与这些培养模型平行发展。在最初的“未成熟/成熟”模型中，GM-CSF骨髓培养中的CD11c⁺细胞主要根据其表型和功能分为增殖性未成熟DCs和成熟DCs。然而，随着“稳态与感染”框架的引入，这一定义在21世纪初经历了范式转变。这一修正的观点将耐受性的、稳态DCs在接触炎症刺激后转化为免疫原性成熟DCs的功能转变重新定义为成熟。此后，出现了各种细致的模型，如“未成熟/半成熟/成熟”模型、“稳态耐受性成熟”和“稳态成熟”。这些现代解释表明，在缺乏外源性炎症信号的情况下产生的CD11c⁺细胞可能代表一个稳态未成熟阶段，尽管它们在表型上与活化的DCs有一定相似性。

在此基础上，Helft及其同事提出了一种分类，将GM-CSF骨髓培养中的CD11c⁺细胞根据功能能力和转录组分析分为MHC II^hi GM-DCs和MHC II^int GM-Macs（GM-CSF诱导的巨噬细胞）。除了这些发现，此后众多研究试图通过在各种物种和实验背景下将CD11c⁺细胞区分为MHC II^hi和MHC II^lo/int亚群来解释其异质性。虽然MHC II^intCD11c⁺细胞因此被表征为巨噬细胞群体，但GM-CSF骨髓培养的异质性表明，GM-Mac也可能包含GM-CSF诱导的DCs（GM-DCs）的前体，这是一个持续争论的主题。鉴于围绕体外生成的GM-DCs发育阶段的命名法不断演变和概念模糊，从个体发育的角度精确表征其功能和发育潜力至关重要。

在本研究中，研究人员评估了GM-CSF骨髓培养中GM-DCs的组成，并鉴定出一个发育和功能上独特的CD32b⁺ GM-DCs亚群，该亚群从GMPs中缓慢出现。与从MDPs衍生而来的早期出现的CD32b^- GM-DCs相比，这些CD32b⁺ GM-DCs表现出延迟的出现动力学、独特的前DC中间体以及增强的刺激CD4⁺ T细胞的能力。

本研究使用的主要关键技术方法包括：基于流式细胞术的细胞表征与分选，以鉴定和分离特定的祖细胞和树突状细胞亚群；高通量RNA测序（RNA-seq）结合主成分分析（PCA）和差异表达基因分析，用于揭示不同DC亚群的转录组特征；以及将分选的祖细胞（GMPs或MDPs）过继转移到CD45.1⁺同源小鼠体内，并结合GM-CSF体内处理，以验证不同祖细胞谱系在体内的分化潜能和动力学。研究中使用的所有小鼠品系，包括C57BL/6、OT-I、OT-II和CD45.1小鼠，均购自商业供应商（Orient Bio和The Jackson Laboratory）并在特定病原体自由条件下饲养。

研究结果首先在“GM-CSF脾细胞培养中DCs主要由GMPs生成”部分表明，与骨髓类似，脾脏中的GMPs而非FLT3^- CMPs是GM-CSF培养体系中MHC II^hi CD11c⁺CD11b⁺ GM-DCs的主要来源。在“MDPs和GMPs在GM-CSF骨髓培养中表现出不同的DC发育动力学”部分，研究人员通过共培养实验证实，虽然MDPs和GMPs都能在GM-CSF培养中产生GM-DCs，但它们的发育动力学显著不同：MDPs衍生的GM-DCs在培养第一周达到峰值，而GMPs衍生的GM-DCs则表现出延迟的动力学，在第二周后才成为主要群体。这种差异是祖细胞的内在特性，与培养条件无关。“骨髓髓系祖细胞以两种不同的动力学模式分化为GM-DCs”部分的分析进一步显示，GM-CSF反应性骨髓祖细胞（包括MDPs、GMPs和FLT3^- CMPs）通过两种截然不同的发育轨迹生成GM-DCs，表现为分化动力学的二元模式。

“FLT3和CD32b区分源自MDP与GMP祖细胞谱系的GM-DCs”部分利用RNA-seq和流式细胞术发现，FLT3和CD32b可以区分这两个发育群体，但由于FLT3在MDP来源的GM-DCs上表达微弱，不适合作为物理分选的表面标记物，而CD32b则在GMP来源的GM-DCs上强表达。随后，“CD32b表达反映了骨髓培养中GM-DCs的祖细胞起源”部分证实，在GM-CSF骨髓培养中，CD32b⁺ GM-DCs的出现动力学与GMP衍生的GM-DCs一致，而CD32b^- GM-DCs与MDP衍生的GM-DCs一致，表明CD32b表达直接反映了GM-DCs的起源。

“TNF-α驱动GM-DCs在骨髓培养后期的扩增”和“前GM-DC异质性及TNF-α驱动的CD32b⁺ GM-DCs特化”部分阐明了延迟出现的分子机制。研究发现，TNF-α的水平在培养后期（第21天）达到高峰，且TNF-α处理能特异性地促进Ly6C^-CD32b⁺MHC II^int前体细胞向CD32b⁺ GM-DCs的分化，而Ly6C^-CD32b^-MHC II^int前体细胞向CD32b^- GM-DCs的分化则不受TNF-α影响。

在功能方面，“GM-DCs的功能专业化揭示了CD32b⁺亚群强大的抗原呈递功能”部分显示，尽管两个亚群在激活CD8⁺ T细胞方面能力相似，但CD32b⁺ GM-DCs在刺激CD4⁺ T细胞增殖和活化（CD25表达）方面始终优于CD32b^- GM-DCs。

最后，“GMPs和MDPs在体内GM-CSF驱动下分化为不同的DC亚群”部分通过过继转移实验证明，在GM-CSF处理的小鼠体内，MDPs能快速产生包括GM-DC1和GM-DC2在内的多样化GM-DC亚群，而GMPs则以较慢的动力学选择性地主要产生CD32b⁺ GM-DC2亚群，后者在GM-CSF处理的肝脏和肺脏中成为主导性DC亚群。

讨论部分总结指出，本研究解决了GM-CSF骨髓培养中GM-DCs细胞起源的争议，证明了其异质性，并确立了CD32b作为区分两个发育和功能不同亚群（CD32b^-和CD32b⁺）的可靠标记物。CD32b⁺ GM-DCs代表了GMP谱系通过单核细胞祖细胞（MoPs）缓慢分化产生的一个独特分支，其发育受到TNF-α的时空调控。该发现将小鼠模型与人类髓系DC的个体发育联系起来，为研究炎症相关DC亚群提供了一个可转化的框架。

研究结论部分（原文翻译）：总之，这项研究阐明了GM-DCs的发育起源，并确立了CD32b作为其异质性的区分标志物。研究人员证明，GM-DCs源于两条不同的祖细胞途径，即MDP-CDP和GMP(MDP)-MoP，导致产生具有不同分化动力学和T细胞刺激能力的亚群。GMP对CD32b⁺ GM-DCs发育的贡献在很大程度上被忽视了，研究结果为GMiDCs和DC3s等新兴亚群的个体发育提供了新的见解。值得注意的是，本研究通过在小鼠中鉴定出一个功能性的GMP来源的DC途径，解决了这些发现的转化意义，从而弥合了与人类髓系DC个体发育之间持续存在的鸿沟。虽然已知人类DCs可以从GMP来源的单核细胞分化而来，但这项工作通过展示该谱系在小鼠中的存在和特征，揭示了一个重要的平行关系。研究人员认为，这个更全面的模型更好地将小鼠数据与人类生物学对齐，提高了将小鼠发现应用于人类免疫学的清晰度和直接性。这为未来研究人类MoDCs的功能和治疗应用提供了一个稳健且可转化的框架。总的来说，这项工作优化了GM-CSF下DC谱系多样化的当前模型，并为在实验和生理背景下研究炎症相关DC亚群提供了框架。未来需要进行体内研究以充分阐明这些谱系关系。