背景：乙型肝炎病毒（HBV）感染通过免疫逃避策略持续存在，包括HBsAg上的α2,6-连接唾液酸聚糖与抑制性受体CD33（Siglec-3）结合。此相互作用诱导ITIM磷酸化和SHP-1/2（含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1/2）募集，抑制髓系细胞活化。单克隆抗体10C8被鉴定为CD33的强效拮抗剂，但其抑制活性的结构基础尚不清楚。方法：研究人员解析了人CD33胞外域（CD33-ECD）与10C8抗体Fab片段（Fab-10C8）复合物的3.2 Å晶体结构。通过尺寸排阻色谱和分析超速离心（AUC）在溶液中验证了复合物的化学计量比和组装状态。通过与apo CD33的结构比较评估了Fab诱导的潜在构象变化，并进行了埋藏表面积分析以表征结合界面。结果：结构显示该复合物为2:2化学计量比，包含两个CD33-ECD分子和两个Fab-10C8片段，与AUC确定的157 kDa分子量一致。每个Fab通过广泛的互补决定区（CDR）相互作用结合V-set结构域，埋藏约612 Å2的表面积，而Fab间的相互作用稳定了CD33-ECD的紧凑二聚体排列。该几何结构与松弛的apo状态显著不同，二聚体角度减少了约21°。抗体结合表位与经典的唾液酸结合槽相邻但不重叠，导致空间位阻，阻止了HBsAg的结合。结合潜在的Fab诱导的胞外域压缩，这种构象限制了CD33聚集，并可能阻止SHP-1/2的募集，为10C8的拮抗活性提供了机制解释。结论：本研究提供了抗体介导抑制CD33的结构见解。通过将CD33锁定在空间位阻、信号传导无反应的构象，10C8有效逆转了HBV诱导的免疫抑制，从而恢复了宿主的抗病毒活性。这些发现为针对慢性病毒感染和其他免疫调节性疾病的Siglec靶向免疫疗法的合理设计建立了结构框架。
乙型肝炎病毒（HBV）感染是重大的全球健康问题，常导致慢性HBV（CHB）感染患者进展为肝硬化和肝细胞癌（HCC）。CHB的特征是四个不同的临床阶段，每个阶段的定义基于不同程度的肝脏炎症、病毒复制和免疫反应。尽管CHB患者能产生针对HBcAg（HBV核心抗原）和HBeAg（HBV e抗原）的抗体，但在感染的所有阶段始终无法产生抗HBsAg（HBV表面抗原）抗体。这一现象与血清中持续存在的HBsAg和HBV DNA密切相关，两者均源于感染肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的活性。虽然理想的治疗目标是清除HBsAg、诱导抗HBsAg抗体并根除cccDNA，但目前获批的抗病毒疗法包括核苷类似物、免疫检查点抑制剂和治疗性疫苗，在实现功能性治愈方面疗效有限。仅少数患者在使用核苷类似物、抗PD-1单克隆抗体（mAbs）或治疗性HBV疫苗治疗后表现出HBsAg的持续减少。值得注意的是，靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点阻断可能在合并CHB的癌症患者中重新激活HBV，突显了非特异性T细胞介导的免疫激活作为治疗策略的局限性。这些发现凸显了探索CHB替代免疫治疗靶点的迫切需求。一个潜在的靶点是HBsAg，其在Asn-146位点携带的双分支α2,6-连接唾液酸聚糖在结构上与内源性人类α2,6-连接唾液酸聚糖相同。已知唾液酸聚糖通过与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（SIGLECs，免疫抑制性受体家族）结合来调节免疫反应。这些受体的胞质区含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM），可募集SHP-1和SHP-2磷酸酶以减弱细胞活化。抑制性SIGLECs的信号传导机制与其他含有ITIM的检查点受体（如PD-1和CTLA-4）相似，后者已成功被癌症免疫治疗中的拮抗性mAbs靶向。SIGLEC编码基因的多态性与多种人类疾病相关，进一步支持了其免疫调节重要性。例如，SIGLEC3（CD33）的单核苷酸多态性（SNPs）与阿尔茨海默病相关，而SIGLEC9和SIGLEC8的变异则分别与慢性阻塞性肺疾病（COPD）和支气管哮喘相关。CD33，也称为SIGLEC-3，是一种跨膜受体，主要表达于髓系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和髓系来源的抑制细胞。结构上，CD33是一种单次跨膜I型膜蛋白，包含一个具有两个免疫球蛋白样结构域（V-set和C2-set）的胞外区（ECD）、一个跨膜α螺旋和一个含有两个保守ITIM的胞质尾部。N端V-set结构域介导唾液酸识别，而C2-set结构域可能稳定配体结合并促进蛋白-蛋白相互作用。配体结合诱导ITIM基序磷酸化，募集SHP-1和SHP-2磷酸酶，启动涉及细胞增殖、分化和免疫抑制的下游抑制性信号级联。CD33也经历N-连接糖基化，这可能影响其配体亲和力、细胞运输和稳定性。N端V-set结构域通过一个以保守的Arg119为中心的位点介导唾液酸识别，该位点与唾液酸羧酸盐形成盐桥。该相互作用进一步由一个芳香族簇（Phe21、His45和Tyr127）和STKYSYK基序（残基124-130）稳定，这些共同提供了该受体对α2,6-连接唾液酸聚糖偏好的结构基础。近期研究已确定CD33是被HBV利用以抑制宿主免疫的免疫检查点受体。具体而言，HBsAg上的α2,6-双分支唾液酸聚糖直接与CD33的唾液酸识别结构域结合，触发CD33 ITIM的下游磷酸化并募集SHP-1/-2，从而促进免疫耐受。在研究人员先前的研究中，证明了一种CD33阻断性单克隆抗体10C8破坏了这种相互作用，并恢复了来自CHB患者外周血单个核细胞（PBMCs）的细胞因子产生。为了更好地理解这种治疗机制的分子基础，研究人员旨在确定CD33/10C8复合物的晶体结构。结构阐明将揭示10C8如何与HBV竞争结合CD33并在空间上阻碍HBsAg重新结合受体。这些见解可以促进抗CD33抗体的合理设计，并支持针对CHB及其向HCC进展的新型免疫疗法的开发。为完成这项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过X射线晶体学解析了人CD33胞外域与Fab-10C8复合物在3.2 Å分辨率下的晶体结构；利用分析超速离心（AUC）和尺寸排阻色谱验证了复合物在溶液中的2:2化学计量比和寡聚状态；通过表面等离子共振（SPR）测定了抗体与抗原的结合动力学；并采用了负染色电子显微镜观察复合物在溶液中的整体构象。蛋白质表达和纯化使用了Expi293F™ GnTI-和ExpiCHO-S™细胞系。研究结果主要分为以下几个部分：在“CD33-ECD/Fab-10C8复合物的形成与表征”部分，研究人员通过SPR证实了10C8与人CD33胞外域具有高亲和力结合（KD为52.5 nM）。尺寸排阻色谱和分析超速离心（AUC）实验表明，当CD33-ECD与Fab-10C8混合时，形成了一个稳定的、表观分子量约为132-157 kDa的复合物，对应2:2的化学计量比，这与溶液中的单体CD33-ECD行为不同，提示Fab结合可能稳定了CD33二聚体。在“CD33-ECD/Fab-10C8复合物的整体结构”部分，晶体结构显示不对称单元包含两个CD33-ECD分子和两个Fab-10C8片段，形成伪二重对称的架构。每个CD33-ECD分子通过其V-set结构域被一个独立的Fab-10C8抗体识别，两个Fab分子向外延伸呈V形排列，且Fab重链可变区（VH）之间存在直接相互作用。在“CD33-ECD通过V-set表位与Fab-10C8抗体形成稳定复合物”部分，结构分析表明，每个Fab分子主要通过轻链和重链的CDR1和CDR3环识别CD33 V-set结构域上一个确定的表位，该表位主要由βC和βD链及其邻近环构成。结合界面富含芳香族侧链（尤其是酪氨酸），提供广泛的埋藏表面积和多种非共价相互作用（如芳香族堆积和氢键）。两个Fab分子与CD33-ECD的结合模式几乎相同。在“Fab结合诱导CD33二聚体发生构象转变”部分，将Fab结合的CD33结构与先前报道的apo CD33结构（PDB: 5IHB）进行比较发现，尽管V-set结构域叠合良好，但C2-set结构域发生了明显的内向位移（RMSD = 2.2 Å），导致胞外域压缩和结构域间夹角变窄。整体而言，Fab结合使CD33二聚体的角度减少了约21°。这种构象变化由广泛的Fab-Fab相互作用驱动，其埋藏表面积（约404.6 Å
2）相当可观。讨论部分总结并深入探讨了这些结构发现的意义。研究人员提出10C8的拮抗机制通过两种协同模式运作。首先，尽管10C8的表位不直接重叠于经典的唾液酸结合槽，但其Fab片段的巨大体积（约50 kDa）在CD33 V-set结构域的关键区域（B′-C环和F-G环区域）施加了空间位阻，物理性地阻止了大型HBsAg修饰的病毒颗粒接近CD33表面。这得到了先前基于患者样本的竞争性结合实验和FRET分析的支持。其次，研究提示CD33信号传导需要配体诱导的聚集而非简单的二聚化。由10C8稳定的2:2复合物采用刚性且紧凑的几何结构，这种结构施加了双重限制：既阻止了进一步侧向组装成高级聚集体，也限制了ITIM可及性和SHP-1/2募集所需的构象灵活性。通过将CD33稳定在这种特定的2:2排列中，10C8有效地将CD33捕获在信号传导无能力的状态。这些结构约束为观察到的免疫细胞活性（包括增强的抗原呈递和细胞因子分泌）的恢复提供了解释。研究还指出，人CD33与小鼠CD33在抑制功能上存在差异，强调了使用人CD33进行结构和功能研究的重要性。结论部分指出，本研究首次提供了抗体介导CD33拮抗的高分辨率结构基础。通过解析CD33-ECD/Fab-10C8复合物，研究表明抗体结合稳定了一种紧凑的二聚体构象，该构象在空间上阻断病毒聚糖结合，并限制了抑制性信号传导所需的构象灵活性。这些发现建立了一个机制框架，说明靶向抗体如何缓解HBV诱导的免疫抑制，并凸显CD33作为慢性乙型肝炎治疗干预的可靶向检查点。
