韩国共和国东方田鼠中新型副黏病毒和hepacivirus的分子流行率、基因组特征及人兽共患潜力

啮齿动物是人兽共患病毒的重要储存宿主，但与人类发生经常性接触的物种仅限于少数几类。既往研究表明，多种啮齿动物可携带新发病毒，包括副黏病毒（Paramyxoviruses）和hepacivirus。芦苇田鼠（Alexandromys fortis）广泛栖息于东亚草地及河岸环境，但其病毒多样性仍缺乏充分表征。本研究对采集自大韩民国（ROK）京畿道农村地区的258份A. fortis样本进行副黏病毒筛查，并进一步实施宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）。研究人员开展了基因组特征解析、系统发育与共系统发育分析，以及信号肽酶切割位点预测，以解析所鉴定病毒的分子特征。采用基于基因组的机器学习模型评估其人兽共患潜力。结果在6份A. fortis样本中鉴定到一种近完整基因组的新型副黏病毒，并命名为Pyeongtaek Alexandromys paramyxovirus（PyAPV），其全部序列均聚类于Jeilongvirus属内。另在4份样本中获得一种啮齿动物相关hepacivirus的近完整基因组，并将其归类为Hepacivirus J种内的一个独特谱系。上述发现证明A. fortis是新发病毒的天然储存宿主，并拓展了当前对ROK啮齿动物相关病毒多样性的认识。

该论文发表于《Veterinary Research》，聚焦韩国共和国东方田鼠（Alexandromys fortis）携带RNA病毒的分子流行病学、基因组特征与潜在人兽共患风险。研究背景在于，新发病毒感染持续威胁动物健康、畜牧生产和公共卫生体系，而野生啮齿动物由于广泛分布于农业区、乡村和城乡结合部，是多类人兽共患病原体的重要储存宿主。副黏病毒科（Paramyxoviridae）与黄病毒科（Flaviviridae）中的hepacivirus均已在多种啮齿动物中被发现，其中部分成员与跨宿主传播和兽医公共卫生风险密切相关。然而，东方田鼠虽已被报道可携带汉坦病毒，并曾提示存在啮齿动物相关副黏病毒，但其整体病毒多样性、系统进化关系及潜在溢出风险仍缺乏系统研究。因此，开展该研究具有重要意义：一方面可补充韩国野生小型哺乳动物病毒谱资料，另一方面有助于理解野生动物—家畜界面上的病毒演化与宿主适应规律。

研究人员围绕2001—2009年间采自韩国京畿道4个农村地区的258只东方田鼠开展调查，重点筛查副黏病毒，并利用无偏宏基因组测序进一步寻找其他病毒。研究最终发现两类RNA病毒：其一是一种新的Jeilongvirus属副黏病毒，命名为Pyeongtaek Alexandromys paramyxovirus（PyAPV）；其二是一种归属于Hepacivirus J种的啮齿动物相关hepacivirus谱系，即Hepacivirus J–Alexandromys。研究结果表明，A. fortis不仅是副黏病毒的自然宿主，也可能是hepacivirus的重要储存宿主之一；两类病毒均呈现明确的宿主相关进化特征，其中PyAPV尤其显示出与宿主长期共分化的信号。机器学习预测进一步提示，这两种病毒均具有中等水平的人兽共患潜力，提示其虽未被证明可感染人类或家畜，但值得在兽医和公共卫生监测中持续关注。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员在京畿道Paju、Pyeongtaek、Pocheon和Yeoncheon农村地区捕获258只A. fortis，取肾组织作为检测样本；通过线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b（cytb）基因测序确认宿主分类；应用巢式聚合酶链式反应（PCR）筛查副黏病毒；从12份代表性样本开展宏基因组下一代测序（mNGS）与de novo组装；结合RACE PCR补充末端序列；随后进行基因组注释、系统发育分析、共系统发育分析、N-连接糖基化位点预测、信号肽酶切割位点预测，以及基于基因组特征的机器学习人兽共患风险评估。

以下为论文结果的核心解读。

Epidemiology of novel paramyxovirus and hepacivirus of Alexandromys fortis
研究人员共分析258只A. fortis，其中雄性97只、雌性161只，样本主要来自Pyeongtaek。副黏病毒分子筛查共检出67份阳性，总流行率为26.0%。雄性阳性率为31.0%，高于雌性的21.9%。在所用引物体系中，针对Respirovirus、Morbillivirus和Henipavirus的特异性引物检出率最高，共检出59份。基于PCR阳性结果及RNA质量，研究人员选取12份代表性样本进入后续mNGS分析。宿主身份经mtDNA cytb测序确认均为A. fortis。该部分结果说明，A. fortis在韩国农村环境中存在较高比例的副黏病毒感染信号，并为后续病毒发现提供了流行病学基础。

Metagenomic next-generation sequencing of PyAPV
对6份RMH阳性样本进行mNGS后，研究人员在所有样本中均获得一种与Jeilongvirus属成员相关的病毒序列，最终重建出6条长度约20 874 nt的PyAPV近完整基因组。其地理分布涉及Paju、Pyeongtaek和Yeoncheon。6条基因组可稳定分为两个遗传簇：Af01-1、Af05-1、Af05-12为一簇，Af04-4、Af09-5、Af09-122为另一簇，两组GC含量略有差异。5′ RACE可将基因组延长29个核苷酸，而3′末端未能成功扩增。PyAPV的基因组结构为3′–N–P/V/C–M–F–SH–TM–G–L–5′，这一结构符合Jeilongvirus属特征，其中F与G基因之间存在SH和TM基因，是该属的重要分子标志。研究还指出，G基因差异最为显著，提示其可能是该病毒基因组中变异最活跃的区域。值得注意的是，本研究未在这些mNGS数据中检出汉坦病毒、沙粒病毒或其他常见啮齿动物相关病毒家族的contig。

Metagenomic next-generation sequencing and genomic organization of Hepacivirus J–Alexandromys
对4份AVU-RUB阳性样本进行mNGS后，研究人员在全部样本中均发现一种啮齿动物相关hepacivirus，而未检测到副黏病毒相关contig。所获Hepacivirus J–Alexandromys近完整基因组长度为9567 nt，GC含量为54.0%，仅在Pyeongtaek样本中检出。该病毒基因组具有典型hepacivirus属特征，仅包含一个5′–Polyprotein–3′开放阅读框（ORF），经切割位点预测可生成10种成熟蛋白，包括3种结构蛋白core、E1和E2，以及7种非结构蛋白p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其与Hepacivirus glareoli的氨基酸相似性为79.1%。这一结果表明，A. fortis中存在明确的hepacivirus感染，并且该病毒在基因组组织上与已知Hepacivirus成员保持高度一致。

Phylogenetic and cophylogenetic analysis of novel PyAPV and Hepacivirus J–Alexandromys
系统发育分析显示，6株PyAPV虽然可分为两个稳定遗传簇，但均与Ninove Microtus virus及Pohorje Myodes paramyxovirus 1共享共同祖先，并稳定归入Jeilongvirus属。基于L蛋白氨基酸序列的分支长度分析表明，PyAPV各簇与最接近已知病毒之间的分支长度达到0.21–0.22，而两个PyAPV簇间分支长度小于0.03，未达到属内物种划分阈值，因此支持将其认定为一个新的Jeilongvirus物种，而非两个独立物种。
对于Hepacivirus J–Alexandromys，系统树显示其与Hepacivirus glareoli构成单系分支，并与感染人、猪和蝙蝠的hepacivirus谱系分离。其NS3与NS5B的成对p-distance分别为0.106和0.148，均低于国际病毒分类委员会（ICTV）物种划界阈值，因此支持将其归入Hepacivirus J，而非定义为新的Hepacivirus物种。
共系统发育分析进一步揭示，PyAPV与宿主之间存在以共分化为主的演化格局，共识别到6次共分化事件、1次宿主跳跃事件和1次丢失事件。PyAPV与其他Cricetidae相关Jeilongvirus形成一致拓扑，并与Muridae相关病毒分开，提示其进化更符合宿主谱系长期分化而非近期频繁跨种传播。这一发现支持Jeilongvirus在科水平上的宿主特异性，以及PyAPV与Microtus类田鼠相关病毒共享古老祖先的观点。

Analysis of N-linked glycosylation (NLG)
研究人员对PyAPV的G蛋白进行了N-连接糖基化（N-linked glycosylation, NLG）位点预测。结果显示，第一遗传簇的3株病毒具有9个潜在NLG位点，第二遗传簇的3株病毒具有11个潜在NLG位点。尽管位点数目和位置存在有限差异，但整体糖基化模式与Ninove Microtus virus和Pohorje Myodes paramyxovirus 1大体相似。该结果说明，尽管PyAPV的G基因在序列水平上存在明显变异，其糖基化相关结构特征仍相对保守，提示该蛋白在结构稳定性或受体相互作用方面可能受到功能约束。

Zoonotic potential of novel PyAPV and Hepacivirus J–Alexandromys
基于基因组的机器学习模型评估显示，PyAPV与Hepacivirus J–Alexandromys均被归类为中等人兽共患潜力。PyAPV的平均预测得分为0.187，低于阈值，但其置信区间（CI 0.095–0.357）跨越阈值，因此属于边界性中等风险。Hepacivirus J–Alexandromys亦得到中等风险判定。研究人员据此认为，这两种啮齿动物相关病毒可能具备一定溢出潜力，但现阶段仅属计算预测结果，尚不能替代实验感染、受体结合或血清学证据。

讨论部分表明，本研究最重要的贡献在于同时从单一啮齿动物宿主A. fortis中发现两个不同类群的RNA病毒谱系，并分别完成较高质量的基因组特征分析。对于PyAPV，研究强调其G基因在两个簇之间的氨基酸一致性最低，仅为75.2%，提示该附着糖蛋白可能是主要变异区域；与此同时，NLG位点模式较保守，说明其功能限制可能强于一级序列变化。对于系统分类，PyAPV虽与比利时M. agrestis中的Ninove Microtus virus亲缘最近，但核苷酸一致性仍较低，且L蛋白系统发育分支长度超过物种划界标准，因此构成新的Jeilongvirus物种。相比之下，Hepacivirus J–Alexandromys虽然形成清晰独立分支，但NS3和NS5B遗传距离仍落在Hepacivirus J种的范围内，因此更适合界定为该物种中的一个宿主相关新谱系。研究还将PyAPV与欧洲啮齿动物病毒的亲缘关系放在欧亚田鼠演化和生物地理扩散框架下讨论，指出宿主长期分化及历史迁移可能塑造了现今观察到的病毒谱系分布。最后，作者也明确指出局限性，包括未能获得完整基因组末端、缺乏病毒分离、缺少复制动力学和组织嗜性实验数据，以及采样区域局限于韩国部分地区。

研究结论部分可译为：
总之，该研究证实在大韩民国A. fortis种群中存在一种新的Jeilongvirus物种以及一条独特的Hepacivirus J谱系。这些发现进一步支持啮齿动物是具有潜在人兽共患相关性的遗传多样化RNA病毒的重要储存宿主。两条不同RNA病毒谱系——Jeilongvirus与Hepacivirus——在同一啮齿动物物种中的同时发现，揭示了病毒—宿主关联的生态复杂性，并凸显将宏基因组学与进化分析相结合对于理解病毒出现和宿主特异性的价值。总体而言，该研究为认识啮齿动物传播RNA病毒的基因组多样性、进化关系及人兽共患风险提供了新的见解，并有助于新发人兽共患病的防范与应对。