民族药理学相关性：桃红四物汤(Taohong Siwu Decoction, TSD)源自清代医书《妇科冰镜》，是治疗血瘀证的代表方剂，具有活血、养血、化瘀的功效。以此为线索，现代研究表明该方剂通过多条途径发挥抗血栓作用，从而为其“活血化瘀”功效提供了关键药理学基础。然而，其药效物质基础尚待进一步阐明。研究目的：本研究旨在通过整合TSD的化学成分、相关生物活性和抗血栓疗效，建立一个多维度的谱效关联模型，以识别与其活血化瘀功效密切相关的质量标志物(Quality Markers, Q-Markers)。材料与方法：采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法(UPLC-QqQ-MS/MS)对TSD中31个成分进行定量分析。通过体外抗凝和抗血小板聚集实验评估其生物活性，并通过斑马鱼血栓模型评估其疗效。本研究采用灰色关联分析(Grey Relational Analysis, GRA)和反向传播神经网络(Back Propagation Artificial Neural Network, BP-ANN)分析了成分-活性、活性-疗效以及成分-疗效之间的相关性。同时，通过生物信息学和分子对接构建了TSD抗血栓成分-靶点-通路网络，识别潜在活性成分。通过斑马鱼模型和定量实时聚合酶链反应(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)进行验证，证实了TSD的多成分、多靶点相互作用，最终确定了其抗血栓Q-Markers。结果：对15批TSD中的31个化合物进行了定量分析。系统聚类分析将这些批次分为四组，并鉴定出地黄(Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex DC.)根的质量是影响TSD质量一致性的主要因素。研究证实了TSD具有体外抗凝和抗血小板聚集活性，以及在斑马鱼模型中令人满意的血栓抑制率。通过结合GRA和BP-ANN，研究人员筛选出19个关键成分；通过分子对接和实验验证，最终筛选出6个化合物：地黄苷D、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素A和绿原酸。这6个成分与GAPDH、IL-6、AKT1、CASP3和EGFR等血栓形成相关靶点表现出强的结合亲和力，最终被确认为TSD活血化瘀功效的Q-Markers。结论：通过多维度谱效关联分析，本研究识别了TSD的活血化瘀Q-Markers。这些发现为TSD的质量标准制定/临床应用奠定了基础，并为中药(TCM)成分-药理学研究提供了参考。
血栓形成是驱动心脑血管疾病（如急性心肌梗死和缺血性中风）进展的关键病理机制，严重威胁人类健康与生命。统计数据表明，心脑血管疾病已成为全球首要死因，每年夺走超过1790万生命。预计到2050年，这一数字将上升至3560万，且此类疾病具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。抗血栓治疗是预防和治疗心脑血管疾病及血栓性疾病的重要策略。目前，临床主要依赖阿司匹林、华法林和肝素等化学药物。然而，这些药物在临床实践中存在一定局限性，如出血风险增加和耐药性问题，影响其长期用药安全性。作为现代药理学中“活血化瘀”功效的重要体现，在优化抗血栓策略的背景下，具有活血化瘀功效的中药因其多成分、多靶点的独特优势而备受关注。中医“血瘀证”概念与血栓形成的病理机制（如高凝状态和内皮损伤）相关联。在血栓性疾病的临床管理中，活血化瘀方剂（如TSD和血府逐瘀汤）已成为重要的治疗选择。临床实践表明，将此类中药方剂与肝素等常规西药抗凝剂联用时，不仅能增强抗凝效果，还能减少西药用量，为患者提供更优的中西医结合防治策略。
作为活血化瘀功效的经典代表方，TSD被收录于《中华人民共和国古代经典名方目录》（第一批，方剂编号97）。该方源自清代医家柴得华所著的《妇科冰镜》，由四物汤加桃仁、红花化裁而成，并通过酒炙工艺增强其活血化瘀功效。酒炙遵循中药炮制理论“酒制升提”，旨在增强药物活血通经、引药上行的能力，利用药材的醇溶性提高疗效并优化其化学组分。TSD由酒炙地黄、酒炙当归、酒炙白芍、炒茺蔚子、炒桃仁和酒炙红花六味药组成。这些药用植物学名经医用植物名称服务(Medical Plant Names Services, MPNS)数据库认证，并与最新更新一致（访问日期：2026年3月7日）。其中，地黄和当归为君药，主养血活血；茺蔚子活血行滞；白芍敛阴养血；红花与桃仁破血逐瘀，增强循环。全方集养血、活血、化瘀之功于一体，主要用于治疗血虚兼血瘀证。现代临床和药理学研究表明，TSD能改善血流动力学参数、修复微循环障碍、抑制血小板活化与聚集。在缺血性中风、冠心病、心肌梗死和静脉血栓形成的临床治疗中已显示出良好疗效。目前，源自经典TSD方的中药新药制剂桃红四物颗粒已获准在中国上市。该制剂为心脑血管疾病及血栓性疾病的综合防治提供了有效中药选择，其产品质量控制和临床疗效日益受到关注。
近年来，中药制剂的质量控制研究取得了显著进展。科学规范的质量标准制定为中医药的传承创新奠定了坚实基础。越来越多的经典方和复方制剂通过多成分定量分析、指纹图谱等技术提高了质量可控性和稳定性。然而，中药复方制剂具有多成分、多靶点的作用机制。当前的质量控制方法主要侧重于单一成分的定量分析，无法全面反映其整体药效物质基础或生物活性。因此，推进中药质量评价的创新方法，特别是建立代表性质量成分、生物活性与治疗功效之间的关联，已成为中药质量研究的关键方向。2016年，刘昌孝院士提出了中药质量标志物(Q-Markers)概念：存在于中药材料中或加工过程中形成，并与中药功能属性密切相关的化学物质。这些物质作为质量控制的标志物，反映了中药的安全性和有效性。在该理论框架下，具有高灵敏度、高分辨率和多成分同步检测能力的UPLC-QqQ-MS/MS，为中药复方中多成分的同步定性和定量分析提供了核心技术手段。生物活性评价是基于生物效应评估药效的方法，正成为中药质量控制的关键方向。美国FDA《行业指南：草药药品开发》明确要求草药通过与其适应症相关的生物活性数据来证明其疗效。《中国药典》（2025年版）已纳入凝血因子效价测定、凝血酶活性试验等生物评价方法，为全面控制中药复方复杂化学组群的药效提供了新途径。同时，斑马鱼作为研究中药抗血栓作用的模式生物被广泛应用。人工智能和神经网络等技术的快速发展，为解析活血化瘀中药的“成分-活性-疗效”关系提供了新的技术工具。
在中药复方临床疗效指导下，本研究以“成分协同-生物活性-抗血栓疗效”为框架，创新性地建立了TSD质量标志物识别的多维度整合策略。首先，采用UPLC-QqQ-MS/MS结合多反应监测(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式，实现了对15批TSD中31个成分的定量分析。随后，对所有15批样品进行了体外抗凝和抗血小板聚集活性检测，并结合斑马鱼模型中反映TSD抗血栓作用的体内药理学指标；这些体内外结合的疗效数据用于评价15批TSD。最后，将TSD的疗效数据与其化学成分相关联，并运用GRA和BP-ANN算法建立多维度谱效关系分析模型，筛选出潜在的药理活性成分。在此基础上，进一步构建了成分-靶点-通路网络，进行分子对接和实验验证，最终识别出与TSD活血化瘀功效相关的抗血栓Q-Marker。本研究克服了传统中药研究侧重于成分、活性和疗效的单层面分析或单一模型验证的局限性，为TSD制剂的精准质量控制提供了科学数据，并为在临床疗效指导下探索中药复方Q-Markers建立了创新范式。
研究背景部分已如上述。目前存在的主要问题是，TSD作为经典活血化瘀方剂，其药效物质基础尚未完全明确，且现有质量控制方法难以全面反映其整体药效。因此，开展本研究旨在建立一种多维度策略，以科学识别其质量标志物，从而提升质量控制水平并阐明其药效物质基础。
研究人员开展了以下主要研究工作：利用UPLC-QqQ-MS/MS技术对15批TSD样品中的31个化学成分进行了定量分析。采用灰色关联分析和反向传播神经网络两种算法，对成分的化学数据、体外抗凝/抗血小板活性数据以及斑马鱼体内抗血栓疗效数据进行了多维度关联分析。构建了TSD的潜在活性成分-作用靶点-信号通路网络，并进行了分子对接。最后，通过斑马鱼血栓模型实验和qRT-PCR检测对筛选出的候选成分进行了体内活性验证。研究得出了明确结论：通过多维度谱效关联分析，最终识别出6个化合物（地黄苷D、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素A和绿原酸）为TSD发挥活血化瘀抗血栓功效的Q-Markers。这项研究具有重要意义，它为TSD的质量标准制定和临床应用奠定了坚实的科学基础，并为中药复方药效物质基础研究提供了一种可借鉴的方法学范式。论文发表于《Journal of Ethnopharmacology》。
作者为开展研究所用到的几个主要关键的技术方法包括：采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法(UPLC-QqQ-MS/MS)进行多成分定量分析；开展体外抗凝和抗血小板聚集活性实验；利用斑马鱼血栓模型进行体内药效评价；运用灰色关联分析(GRA)和反向传播神经网络(BP-ANN)算法进行多维度谱效关联数据分析；以及通过网络药理学构建成分-靶点-通路网络并结合分子对接进行机制预测。研究样本队列来源于随机组合制备的15批TSD样品。
研究结果部分，首先，通过对15批TSD中31个化合物的UPLC-QqQ-MS/MS定量分析，系统聚类分析表明这15批样品可分为四组，其中地黄的质量是影响TSD整体质量一致性的主要因素。
其次，通过体外实验，研究人员证实了TSD具有显著的抗凝活性（延长凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间）以及抑制血小板聚集的作用。同时，在斑马鱼体内模型中，TSD也显示出令人满意的血栓抑制率，证实了其体内抗血栓功效。
接着，通过结合灰色关联分析和反向传播神经网络算法，研究人员从31个成分中筛选出了19个与活性及疗效关联密切的关键成分。
进一步地，通过构建这些关键成分与血栓形成相关靶点（如GAPDH、IL-6、AKT1、CASP3、EGFR等）的网络，并进行分子对接分析，锁定了6个结合能力较强的化合物：地黄苷D、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素A和绿原酸。
最后，通过斑马鱼模型进行药效验证，并利用qRT-PCR技术检测相关靶基因（如IL-6）的表达，最终从实验上确认了这6个成分是TSD发挥活血化瘀抗血栓功效的物质基础，即Q-Markers。
在讨论部分，研究人员指出本研究建立的“成分协同-生物活性-抗血栓疗效”多维度谱效关联分析策略，有效克服了传统单一指标或单一模型评价的局限性，能够更全面、更系统地揭示中药复方复杂的药效物质基础。通过整合化学分析、多种生物活性评价和网络药理学分析，本研究成功识别出的6个Q-Markers，不仅与TSD的临床功效紧密相关，也为该方剂后续的质量控制标准提升、药效机制深入研究以及临床精准用药提供了科学依据和物质基础。该研究模式对于其他经典中药复方的质量标志物探索具有重要的参考价值。
本研究结论部分为：本研究采用UPLC-QqQ-MS/MS定量分析了TSD中31个成分的含量。整合了体外抗凝和抗血小板聚集生物评价以及斑马鱼血栓模型，建立了以“成分协同-生物活性-抗血栓疗效”为核心的多维度谱效关联分析框架。通过双GRA和BP-ANN算法，分析了TSD成分、生物活性与疗效之间的关联，并结合网络药理学和实验验证，最终识别出地黄苷D、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、羟基红花黄色素A和绿原酸这6个化合物为TSD发挥活血化瘀抗血栓功效的Q-Markers。
