一种智能荧光探针，可用于细胞膜、肿瘤和急性肾损伤中pH值及过氧亚硝酸盐的双通道成像

Jinzheng Zhang|Bo Zhao|Siyu Jiang|Yijia Liu|Guoqiang Feng

教育部光能利用工程研究中心（用于污染控制和碳减排），华中师范大学化学学院，中国武汉珞喻路152号，430079

摘要

细胞膜（CM）是细胞的“门户”，参与细胞间信号传递和物质运输活动。细胞膜上微环境及活性物质的异常变化可以反映细胞的状态和疾病情况。准确、灵敏地检测细胞膜上的化学和微环境信号具有重要的生物学意义。荧光探针能够在细胞和生物体内提供高灵敏度的实时成像，使其成为疾病诊断的重要工具。然而，能够通过双通道成像同时监测细胞膜上的微环境和特定活性物质的探针仍然很少。本文报道了一种新型荧光探针RS，它可以同时响应pH值（λ_em约750 nm，pKa约6.01）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻（λ_em约495 nm，检测限3.6 nM），实现双通道荧光信号采集。更重要的是，RS的两亲性结构使其能够有效靶向细胞膜，并分别成功揭示癌症和横纹肌溶解诱导的急性肾损伤中细胞膜上pH值和ONOO⁻的变化。这为同时成像细胞膜上的微环境和活性物质提供了一种新型智能分子探针，也为相关疾病的诊断和研究提供了新的视角。

引言

作为细胞的最外层屏障，细胞膜（CM）不仅确保了细胞环境的稳定性和生化反应的有序进行，还在信号转导和物质运输中起着关键作用[1]。深入探索细胞膜上的生化信息有助于理解细胞的动态变化，并有助于揭示与细胞膜相关的各种疾病的病理过程[2]、[3]。先前的研究表明，在疾病早期阶段，细胞膜上的微环境（如极性、粘度、pH值等）可能会出现异常[4]、[5]。其中，细胞膜上的pH值变化可以反映细胞内外环境的状态，可作为诊断的重要依据之一[6]、[7]、[8]、[9]。此外，过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）是一种重要的活性氧（ROS），其含量的异常波动也会影响细胞膜上的化学信号，表明病变的发生[10]、[11]。因此，同时监测细胞膜上pH值和ONOO⁻的变化对于相关疾病的早期诊断具有重要意义[12]。然而，由于细胞膜特殊的流动性和通透性结构以及缺乏有效的监测方法，这项研究仍然具有挑战性[13]。

作为一种先进的分析检测方法，基于荧光探针的成像技术因其高灵敏度、高分辨率、无创成像和原位实时监测能力而被广泛应用于细胞和体内检测[14]、[15]、[16]。荧光探针可以根据病理活动期间微环境或活性物质（酶、离子、氨基酸等）的差异进行设计，从而实现有效的区分和精确检测[17]、[18]、[19]。最近，我们的研究团队构建了一系列荧光探针，利用癌细胞/肿瘤之间的极性或粘度差异，在细胞膜水平上实现了癌症诊断（图1A，表S1），展示了细胞膜荧光探针在区分癌细胞和正常细胞方面的巨大潜力[20]、[21]、[22]、[23]。为了提高检测的准确性并避免这些单生物标志物和单通道信号探针可能导致的“假阳性”结果，需要进一步开发新的双生物标志物和双通道荧光探针[24]、[25]、[26]。双通道响应探针可以同时响应两种不同的信号或参数，提供更丰富的信息和更高的准确性[27]、[28]。然而，很少有探针能够在保持高疾病检测效率的同时，成功实现对细胞膜上微环境因素和化学物质的双通道荧光响应。

本文报道了一种新型荧光探针（命名为RS，图1B），它可以同时检测细胞膜上的pH值和ONOO⁻变化。RS具有两亲性结构，能够靶向细胞膜。在生理条件（pH 7.4）下，RS的pKa约为6.01，并在约750 nm处表现出强烈的近红外（NIR）荧光。RS的NIR荧光不受极性或粘度的影响，但对pH值的变化具有敏感的响应。同时，RS对ONOO⁻有特异性响应，在约495 nm处产生敏感的绿色荧光信号。基于这些特性，RS实现了对细胞膜上ONOO⁻和pH值的双通道荧光检测。此外，使用RS发现癌细胞膜呈现绿色荧光，而正常细胞膜呈现红色荧光，从而实现了细胞膜上癌细胞和正常细胞的双色荧光区分。此外，RS还可用于急性肾损伤（AKI）的研究，在横纹肌溶解诱导的AKI期间实现了ONOO⁻和pH值的双通道荧光检测。这些研究表明，RS可以通过双通道同时监测细胞膜上两种生物标志物的变化，为相关疾病的细胞膜水平诊断提供了强大的智能分子工具。

章节片段

实验部分

实验的一般情况、合成和表征详见补充数据。

RS包含一个花青素部分和一个吡啶单元，两者通过C=C桥连接，形成一个大的共轭体系。引入硫酸盐以提高其水溶性，使RS具有两亲性，为靶向细胞膜提供了基础[1]、[2]。同时，RS也是一个D-π-A体系，其中二乙氨基团是电子供体（D），带正电的吡啶单元是电子受体（A），增强了分子内的电荷转移（ICT）并延长了荧光

结论

总之，我们开发了一种基于花青素和吡啶共轭结构的两亲性荧光探针RS，它可以有效靶向细胞膜，并在双荧光通道中同时检测pH值和ONOO⁻。RS具有独特的性质，包括靶向细胞膜、对pH值的选择性近红外（NIR）荧光响应以及对ONOO⁻的选择性绿色荧光响应。凭借这些性质，RS能够有效区分癌细胞的细胞膜和正常细胞的细胞膜

Siyu Jiang：撰写——原始稿件、方法学、实验研究。Bo Zhao：撰写——原始稿件、方法学、实验研究。Jinzheng Zhang：撰写——原始稿件、方法学、实验研究、数据分析、数据管理。Guoqiang Feng：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Yijia Liu：撰写——原始稿件、方法学、实验研究。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

本工作得到了国家自然科学基金（22577035, 22077044）和武汉光化学与技术研究所（GHY2023KF008）的资助。

Jinzheng Zhang是中国武汉华中师范大学化学学院的博士生。