S-棕榈酰化(S-palmitoylation)是一种可逆的翻译后修饰，通过硫酯键将棕榈酸共价连接于蛋白质的半胱氨酸残基上。该反应由蛋白酰基转移酶(protein acyl transferases)催化，并由酰基蛋白硫酯酶(acyl protein thioesterases，亦称S-去棕榈酰化酶/S-depalmitoylases)逆向水解。本研究优化了酰基树脂辅助捕获(acyl resin-assisted capture, acyl-RAC)法，用于鉴定模式真核生物盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)中的S-棕榈酰化蛋白。利用此优化方案及Western blotting，研究人员揭示了D. discoideum中受S-棕榈酰化修饰的蛋白，包括钙依赖性细胞黏附蛋白A(calcium-dependent cell adhesion protein A, CadA)、钙网蛋白(calreticulin, CalR)及葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, Grp78/BiP)。总之，本工作确立了acyl-RAC作为研究D. discoideum中S-棕榈酰化的有效工具，并鉴定了该模式生物中可被进一步研究的S-棕榈酰化蛋白子集。
本文对发表于《Biochemistry and Cell Biology》的论文《An optimized protocol for identifying S-acylated proteins in Dictyostelium discoideum》进行解读与总结。
研究背景与立题依据
脂质化(lipidation)是蛋白质最常见的翻译后修饰(Post-Translational Modifications, PTMs)之一，约25%–40%的膜相关蛋白会发生脂肪酸链共价连接。其中S-棕榈酰化(S-palmitoylation)是指将16碳饱和脂肪酸——棕榈酸通过硫酯键共价结合于蛋白质半胱氨酸残基的巯基(-SH)上，是唯一可逆的脂质修饰，由含DHHC(Asp-His-His-Cys)基序的棕榈酰酰基转移酶(PATs)催化，并由酰基蛋白硫酯酶(APTases/S-depalmitoylases)去除。目前研究S-棕榈酰化的方法包括代谢标记、酰基生物素交换(acyl Biotin Exchange, ABE)、酰基树脂辅助捕获(acyl Resin-Assisted Capture, acyl-RAC)及较新的acyl-TRAP。其中acyl-RAC因兼顾灵敏度、稳健性和成本被视为最实用的方法：先烷基化封闭游离巯基，经羟胺(hydroxylamine, HAM)选择性裂解S-棕榈酰化的硫酯键释放新巯基，再被硫醇反应性捕获树脂(Thiol-Sepharose)富集，最后洗脱进行Western blotting或质谱分析。盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是具有独特单/多细胞双相生命周期的模式真核生物，广泛用于保守的细胞与发育过程研究，但其S-棕榈酰化的功能、催化酶特征及对该生命周期的调控尚不清楚。为此，研究人员旨在建立并优化适用于D. discoideum的acyl-RAC方案，以鉴定其S-棕榈酰化蛋白。
主要关键技术方法
研究人员采用AX3及其他轴突营养型D. discoideum细胞株，于HL5富营养培养基中22℃悬浮培养至对数中期(1–5×106 cells/mL)，贴壁收集并经PBS洗涤后，用含DDM、抑制剂及PMSF/EDTA的裂解缓冲液冰上裂解。核心实验流程为优化的acyl-RAC：取2 mg总蛋白进行氯仿-甲醇(Chloroform-Methanol, CM)沉淀去除脂类及去垢剂，蛋白沉淀用制备缓冲液重悬，以0.8% S-甲基甲基硫代磺酸酯(S-methyl methanethiosulfonate, MMTS)于42℃封闭所有游离巯基；再次CM沉淀清洗后分两组，实验组加羟胺(HAM, 终浓度1600 mmol/L)裂解S-棕榈酰化硫酯键释放巯基，阴性对照组加等体积NaCl溶液；随后加入活化的硫醇-Sepharose 4B(Thiol–Sepharose 4B)捕获树脂室温旋转孵育2 h，严格洗涤后以含β-巯基乙醇的Laemmli上样缓冲液80℃洗脱。洗脱产物及输入对照(input)行SDS-PAGE及Western blotting检测，抗体包括抗CadA、抗CalR(DSHB来源)、抗Grp78及阴性对照抗CtsD、CtnA、Sort1；部分洗脱树脂可送质谱分析。预测工具采用SWISS-PALM数据库批量检索D. discoideum预测S-棕榈酰化蛋白。
研究结果
Identifying S-palmitoylated proteins using SWISS-PALM
研究人员通过SWISS-PALM在线工具选择"Dataset 2: Proteins predicted to be palmitoylated"及物种"Dictyostelium discoideum"进行批量检索，获得6917条蛋白条目中2047条(30%)预测具S-棕榈酰化位点，据此筛选可用商品化或定制抗体验证的候选靶蛋白(CadA、CalR、Grp78)及已知非S-棕榈酰化阴性对照(CtsD、CtnA、Sort1)。
Prepare the cell extract / Block-free thiol groups on proteins / Capture S-palmitoylated proteins
按上述acyl-RAC操作流程，研究人员发现将原哺乳动物细胞acyl-RAC缓冲液pH从7.4调至6.5(pH maintenance buffer保持pH 6.5)显著提高D. discoideum蛋白捕获效率，这与D. discoideum常用培养缓冲液pH一致。因CM沉淀致蛋白回收率下降，需提高起始总蛋白量至2 mg；同时为提高低pH下MMTS封闭效率将MMTS浓度增至0.8%(v/v)，对应地将HAM浓度提升至1600 mmol/L以保证硫酯键充分裂解及后续树脂捕获。完成封闭、HAM处理及Thiol-Sepharose 4B捕获、洗涤、β-巯基乙醇洗脱后得到±HAM样本及Input对照。
Identifying S-palmitoylated proteins using Western blotting
Western blotting结果显示，经HAM处理的(+HAM)样本中检测到CadA、CalR及Grp78信号，而未加HAM的(−HAM)阴性对照及Input中仅在Input见全蛋白泳道，−HAM无捕获信号，证明这些蛋白的捕获依赖于HAM对硫酯键的特异裂解，即CadA、CalR和Grp78在D. discoideum中为S-棕榈酰化蛋白。阴性对照蛋白CtnA、CtsD及Sort1在+HAM与−HAM样本中均未被捕获，与SWISS-PALM预测一致，验证了方法的特异性。
讨论与结论翻译总结
本研究报道了适用于盘基网柄菌(D. discoideum)的acyl-RAC方案优化：缓冲液pH调至6.5，MMTS增至0.8%，HAM增至1600 mmol/L，起始蛋白量提至2 mg并经CM沉淀除干扰。利用该方案研究人员首次在D. discoideum中证实钙依赖性细胞黏附蛋白A(CadA)、内质网分子伴侣钙网蛋白(CalR/calreticulin)及葡萄糖调节蛋白78(Grp78/BiP)发生S-棕榈酰化修饰，其中CadA与哺乳动物钙黏蛋白(cadherin)家族类似具S-棕榈酰化特征，Grp78在人细胞中已有报道支持，CalR在人中未报道S-棕榈酰化但D. discoideum CalR与具预测S-棕榈酰化的CALR3同源，提示其潜在保守性。阴性对照CtnA(聚集素A)、CtsD(组织蛋白酶D)及Sort1(sortilin同源物)未被HAM依赖捕获，符合预测且佐证方案特异性。本工作确立acyl-RAC为D. discoideum中可靠的S-棕榈酰化蛋白分离鉴定工具，并为探究S-棕榈酰化在该模式生物细胞与发育过程中的调控作用及扩展至多细胞发育阶段奠定基础。需注意该方法特异性富集S-棕榈酰化蛋白，不捕获N-或O-棕榈酰化，且高丰度S-亚硝基化(S-nitrosylation)或S-乙酰化蛋白理论上可能被共富集，需结合对照排除。
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