大量合成与天然有机化合物进入水体，威胁公共健康与生态系统。当传统水处理方法不足以去除有害污染物时，高级氧化与还原过程（Advanced Oxidation/Reduction Processes, AOPs/ARPs）通过产生活性物种（Reactive Species, RS）降解污染物，提供了一种有前景的替代方案。液相色谱联用高分辨串联质谱（Liquid Chromatography coupled with High-Resolution tandem Mass Spectrometry, LC-HR-MS/MS）已被广泛应用于通过检测AOP/ARP过程中产生的转化产物（Transformation Products, TPs）来阐明降解路径。然而，大多数已报道的研究针对某些特定的怀疑TPs，而非利用LC-HR-MS/MS提供的完整信息。本研究应用先进的计算代谢组学流程探索非靶向HR-MS/MS数据，包括分子网络（Molecular Networking）和化学比例性（Chemical Proportionality）分析，以提供对AOP/ARP降解路径的新见解和更全面的视角。研究人员选择了循环肽类蓝藻肝毒素微囊藻毒素-RR（Microcystin-RR, MC-RR）作为底物，并应用水辐射化学原理以已知产率选择性地产生RS。观察到所有RS均能降解MC-RR，降解剂量常数遵循HO•>H•>eaq->HOO•/O2•-的顺序，范围从0.0021 Gy-1（HOO•/O2•-）到0.0476 Gy-1（HO•）。通过结合LC-HR-MS/MS与计算分析工具，研究人员能够注释已知和新型的TPs，表明降解路径包括氧化条件下的羟基化与异构化，以及还原条件下的氢化和胍基/甲氧基还原。所提方法增强了对AOP/ARPs降解路径的解析能力，并为研究和优化水处理技术以去除各类有机微污染物提供了潜力。
气候变化、城市化、人口增长和日益加剧的水资源短缺对全球水资源构成重大挑战。大量有害合成化学品和天然毒素污染水源，导致水质下降并威胁生态系统和人类健康。其中，有害蓝藻水华已成为淡水供应的关键威胁。因此，亟需弥补关于蓝藻毒素（cyanotoxins）及其他生物活性代谢物在环境与水处理过程中的检测、特性、环境效应及降解路径方面的知识空白。微囊藻毒素（Microcystins, MCs）由多种蓝藻产生，是常见的淡水蓝藻毒素之一。它们构成一个包含300多种已知同系物的大家族，具有环状七肽结构cyclo(-D-Ala-X-D-MeAsp-Y-Adda-D-Glu-Mdha-)，其中X和Y为可变氨基酸，Adda为非核糖体β-氨基酸（(2S,3S,8S,9S)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸）。MCs具有肝毒性，是强效蛋白磷酸酶抑制剂，其在水中的存在与多起动物和人类中毒事件有关。针对MCs带来的风险，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）为一种常见同系物MC-LR设定了终生（1 μg/L）和短期（12 μg/L）饮用水指导值。
高级氧化/还原过程（AOPs, ARPs）作为处理合成与天然污染物的有效替代传统水处理方法，正受到越来越多关注。通常，AOPs涉及原位产生活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS）。羟基自由基（HO•）通常是主要物种，通过加成、氢抽提或电子转移与富电子有机化合物反应，产生的氧化产物在大多数情况下毒性较低。已有多种AOPs被研究用于水净化，包括Fe
2+/H
2O
2、UV/H
2O
2、UV/O
3、UV/S
2O
82-、UV/HSO
5-、UV/TiO
2、声解和电化学过程等。近年来，ARP也受到考虑，利用如水合电子（e
aq-）或其质子化形式（H•）等物种，在通过解离性电子捕获进行有机污染物脱卤等情况下有效。应用各类AOPs/ARPs降解水中有机污染物是众多研究的目标，涵盖农药、药品、工业化学品、天然毒素和异味化合物等。此类研究通常旨在评估该过程降解污染物的有效性、确定污染物与活性物种（RS）反应的速率常数，或表征处理过程中形成的产物。阐明转化产物（TPs）和路径极具挑战性，因为AOP/ARP反应中的自由基物种通常是非选择性的，会攻击底物分子的多个位点，导致大量产物的产生。
质谱（Mass Spectrometry, MS）与液相和气相色谱（LC, GC）联用，尤其是高分辨质谱（High-Resolution MS, HR-MS），是一项强大的技术，可用于已知化合物的靶向检测与定量，以及复杂水样中未知物的非靶向表征。此外，基于质谱的代谢组学在探索水生微生物代谢物及其生态作用方面具有巨大潜力。近年来，HR-MS已被应用于AOPs/ARPs研究，旨在阐明各种有机水污染物的降解路径。然而，注释TPs的MS峰的能力有限，因为其MS/MS谱图通常不包含在光谱库中。通常只有基于对简单预期反应的经验预测，才能注释少量的TPs，而数据集中最大比例的MS和MS/MS谱图被忽略。
基于质谱的计算代谢组学的最新进展和开发提供了能够分析样品完整化学组成并扩展已知和未知化合物注释的工具。基于特征的分子网络（Feature-Based Molecular Networking, FBMN）通过对齐实验MS/MS谱图并根据其光谱相似性连接相关分子来组织非靶向MS数据。分子网络中的相关分子代表结构修饰，并以“分子家族”形式可视化，从而实现注释在整个网络中的传播。网络注释传播（Network Annotation Propagation, NAP）通过使用分子网络拓扑结构和结构相似性重新排序结构候选物来改善计算注释。化学比例性（Chemical Proportionality, ChemProp）对时间序列数据中两个相连分子之间的丰度变化进行评分，以确定化学转化路径中产物的潜在前体物。下游分析和统计查询可以从复杂的FBMN数据矩阵中揭示分子层面的洞见。这些计算和统计工具内置于全球天然产物社交分子网络（Global Natural Products Social Molecular Networking, GNPS2）生态系统中，用于质谱数据的共享和社区维护。
非靶向MS方法结合上述计算工具为代谢组学领域的进步做出了重要贡献。然而，据研究人员所知，这些方法尚未被AOP/ARP研究界采纳。例如，已应用各种AOPs来降解水中的MCs并提出降解路径，但未利用计算工具来探索处理过程中完整的MS数据以寻找质谱相似性和比例性。虽然已为MCs与HO•的反应提出了若干TPs，但研究结果分散在各项研究中。已发表的数据表明了三种主要的氧化路径：i) ADDA片段内的修饰，ii) 环状结构的裂解，以及iii) 更深度氧化的产物。多项研究表明，降解主要发生在ADDA片段的共轭双键或芳香环上，通过脱甲基和羟基化，导致产物如羟基化的ADDA或其他芳环打开的产物，这些产物通常比母体化合物毒性更低。环状结构裂解伴随羟基化，产生线性结构以及酮、醛和羧酸等产物。进一步氧化可导致矿化，其中二氧化碳和硝酸盐/亚硝酸盐是主要最终产物。
基于AOPs/ARPs中多种RS参与并引发有机污染物不同转化路径的假设，研究人员旨在受控条件下分别研究氧化性和还原性物种，以理解每种RS在降解过程中的作用。为此，研究人员采用了水辐射化学原理，其中稀水溶液吸收高能电离辐射（γ射线）会产生氧化性（羟基自由基HO•和过氧/超氧自由基HOO•/O
2•
-）和还原性（氢原子H•和水合电子e
aq-）RS。通过化学清除剂适当操作辐射化学体系有利于产生单一RS，且其产率（G值）明确，从而能够研究每种RS诱导的反应路径。为探索这些受控条件下的降解过程，研究人员选择了一种常见但研究较少的MC同系物MC-RR（一种天然环状七肽肝毒素）作为底物。通过应用整合了LC-HR-MS/MS、分子网络、化学比例性分析和多元统计方法的非靶向分析工作流程，表征了在每种RS条件下形成的TPs。本研究的主要目标是引入新的工作流程，将LC-HR-MS/MS与计算和统计工具相结合，以利于未来利用AOP/ARP研究水处理中有机污染物降解路径的阐明。
为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先利用水辐射化学原理，通过γ射线照射并配合化学清除剂，实现了对单一活性物种（如HO•, H•, e
aq-, HOO•/O
2•
-）产生的精准控制，样本来源于NCSR Demokritos研究所。其次，采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC-HR-MS/MS）进行非靶向数据采集。最后，应用先进的计算代谢组学流程进行数据分析，该流程集成了基于特征的分子网络（FBMN）以构建分子家族、化学比例性分析（ChemProp2）以推断转化关系、网络注释传播（NAP）以增强注释，以及下游的多元统计分析。
研究结果部分主要包括：首先，通过辐射降解实验，研究人员定量评估了不同RS对MC-RR的降解效率。结果显示，所有RS均能降解MC-RR，且降解剂量常数遵循HO• > H• > e
aq- > HOO•/O
2•
-的顺序，表明羟基自由基是最高效的氧化剂，而还原性物种（H•, e
aq-）也表现出显著的降解能力。
其次，通过将LC-HR-MS/MS数据与计算工具相结合，研究人员成功注释了一系列MC-RR的转化产物，其中包括已知的和新型的TPs。这得益于FBMN网络将具有相似MS/MS谱图的分子连接起来，便于注释的传播；ChemProp2分析则通过关联不同时间点产物的丰度变化，帮助推断了前体-产物关系；NAP工具进一步优化了计算预测的准确性。
再次，基于对注释产物的分析，研究人员推导并阐明了不同RS条件下MC-RR的主要降解路径。在氧化条件（HO•, HOO•/O
2•
-）下，主要路径包括Adda侧链的羟基化与异构化，以及可能的环状结构开环与进一步氧化。在还原条件（H•, e
aq-）下，主要路径包括Adda侧链中双键的氢化，以及胍基（来自精氨酸残基）和甲氧基（来自Adda）的还原。
最后，研究人员指出，本研究所建立和验证的结合LC-HR-MS/MS与计算代谢组学工具的非靶向分析工作流程，不仅适用于MC-RR，也为全面解析各类有机污染物在AOP/ARP处理过程中的复杂降解路径提供了通用方法，有助于更好地理解和优化相关水处理技术。
在讨论部分，研究人员强调了还原性物种（e
aq-, H•）在降解富电子化合物方面的高效性，这主要归因于它们对不饱和结构的选择性。将LC-HR-MS/MS与FBMN和ChemProp2分析相结合的方法，显著提升了对转化产物网络和路径的解析能力，超越了传统靶向或半靶向方法的局限性。该方法能够从海量数据中系统性地提取化学信息，发现以往被忽略的微量或结构新颖的转化产物。
论文的结论部分指出，本研究的主要目的是引入一种利用MC-RR作为模型肽，研究水处理中AOP/ARPs的新方法，重点关注有机污染物的化学转化路径。动力学分析证明了还原性物种（e
aq-, H•）在降解富电子化合物方面的高效率，这主要归因于它们对不饱和部分的选性。通过整合LC-HR-MS/MS与FBMN和化学比例性分析（ChemProp2），研究人员成功地注释了已知和新型的转化产物，阐明了在氧化和还原条件下不同的主要降解路径。该研究提出的工作流程增强了对AOP/ARPs降解路径的解析能力，并有望应用于优化水处理技术以去除各类有机微污染物，为未来相关研究提供了有力的分析范式。
