背景：急性高原病（AHAI）涉及由低氧驱动的氧化和炎症应激，而红景天苷（SAL）受限于较短的口服存留时间。方法：本研究制备了SAL@AKK，一种通过真空辅助联结（vacuum-facilitated association）红景天苷（SAL）与Akkermansia muciniphila（AKK）生成的制剂，并评估了其在模拟肠道液中的体外释放行为，以及在暴露于模拟海拔（6000米，2小时）的斑马鱼模型中的预防功效。研究人员评估了行为表现、氧化应激指标、炎症细胞因子以及鳃组织病理学。结果：SAL@AKK在模拟肠道液中表现出SAL的逐渐释放。与AHAI对照组相比，它改善了运动/探索行为，减少了僵直行为。该制剂降低了活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，恢复了谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并降低了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，同时减轻了鳃部的炎症浸润。在所有终点指标上，SAL@AKK表现出比单独使用SAL或AKK更强的整体效果。相关性及主成分分析（PCA）表明行为、氧化还原和炎症参数之间存在协调变化。结论：与AKK的真空辅助联结增强了SAL对抗AHAI相关氧化和炎症应激的功能功效。
本研究的背景是，随着旅游和经济活动在高海拔地区的快速扩展，越来越多非习服个体从低海拔地区迁移至海拔≥2500米的区域。暴露于低气压、强辐射和低温环境会降低动脉血氧饱和度，从而引发急性高原病（AHAI）。AHAI的发病率在海拔4000米以上可达约90%。对于中高风险上升者，强烈考虑进行药物预防。乙酰唑胺（Acetazolamide）仍是一线预防药物，但它需在上升前24–48小时开始给药，并可能引起感觉异常和电解质紊乱等不良反应。因此，更安全、耐受性更好的预防方案仍有需求。
天然产物因其通常良好的耐受性和代谢安全性而成为有吸引力的候选药物。红景天苷（Salidroside，SAL）是红景天（Rhodiola rosea）的主要生物活性成分，具有抗缺氧、抗炎、抗氧化和心血管保护活性，提示其在AHAI预防中具有潜在应用价值。从机制上讲，SAL能减少活性氧（ROS）和丙二醛（MDA），增强抗氧化防御（如过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平），并通过调节如核因子κB（NF-κB）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）等通路，减轻低压低氧诱导的损伤，从而减少促炎细胞因子（如白细胞介素（IL）-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））。然而，SAL的临床应用受限于其短半衰期（0.5–2小时），需要频繁或更高剂量给药，可能导致全身暴露量的大幅波动。此外，P-糖蛋白（P-glycoprotein）介导的外排和肠道菌群的降解也可能进一步影响其口服生物利用度。因此，开发一种能够改善肠道滞留并实现缓释的口服制剂是必要的。
现有的SAL递送策略主要依赖于脂质体、纳米粒子和微囊化技术。然而，许多传统的药物修饰方法在稳定性和转化安全性方面面临局限，且大多数作为被动载体，与肠道微环境的主动相互作用能力有限。近年来，益生菌作为一种口服递送载体崭露头角，能够改善药物在胃肠道的表现。虽然基于表面吸附的益生菌载体已相对成熟，但真空辅助的微生物负载技术可能提高化合物的结合与滞留能力，同时保持微生物载体本身的生物活性。值得注意的是，负压方法已被证明能显著增强生物活性物质向酵母微载体的输注，与被动扩散相比，改善了负载动力学和包封产率。这些发现促使研究人员开发利用活体微生物的真空辅助联结策略，以同时实现高效负载和保持活性。
Akkermansia muciniphila（AKK）是一种革兰氏阴性、厌氧、卵圆形的下一代益生菌。其外膜蛋白（如Amuc）已在体内与减轻炎症和氧化应激相关，并且AKK可以定植肠道，重塑失调的菌群，并在急性肺损伤模型中改善炎症和氧化损伤。现有的AKK相关递送工作主要集中在使用纳米粒子、水凝胶或类外泌体系统来提高其在胃转运过程中的稳定性，或者利用其膜蛋白作为功能性治疗剂。相比之下，构建能够携带SAL并在肠道样条件下支持其逐渐释放的活体AKK制剂尚未得到充分探索。
斑马鱼已被证实为构建AHAI样表型的实用模型。此外，由于斑马鱼缺乏与哺乳动物相当的明确分隔的胃结构，它们为对强胃酸敏感的益生菌系统提供了有效的初步评估平台。在本研究中，研究人员通过真空辅助联结SAL与AKK（SAL@AKK）构建了一种简单的活细菌制剂。优化了真空处理条件以平衡细菌活性和SAL结合效率，随后在模拟肠道液中表征了累积释放和释放动力学。然后，使用行为学评估、炎症细胞因子检测、氧化应激指标和组织病理学分析，在斑马鱼AHAI模型中评估了SAL@AKK的预防功效，以单独使用SAL或AKK作为对照。研究还进一步探讨了行为学终点、炎症反应和氧化应激之间的关联。因此，本研究旨在确定通过真空辅助联结SAL与活体Akkermansia muciniphila是否能提供一种基于益生菌的缓释策略，以增强对AHAI相关应激反应的保护作用。
在材料与方法部分，研究人员首先培养并表征了AKK。AKK在37°C的流体硫乙醇酸盐培养基中厌氧培养至对数生长期。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察了其形态。通过动态光散射（DLS）测量了其水动力尺寸和Zeta电位。为确定保持AKK活性的真空处理条件，将AKK悬浮液置于37°C的真空干燥箱中，分别处理2、4、6、8和10小时，通过平板计数法量化细菌存活率。
SAL@AKK的制备采用真空辅助联结策略。建立了SAL的HPLC标准曲线。将AKK悬浮液与SAL溶液混合，进行0.5至10小时的真空共孵育。通过HPLC定量上清液中SAL浓度，计算包封率（EE%），以确定最大负载的条件。在最优条件下制备SAL@AKK，并表征其形态、水动力直径和Zeta电位。
体外释放研究在模拟人工肠液中进行。将SAL@AKK悬浮液加入肠液中，在37°C振荡孵育24小时。定时取样，通过HPLC测定释放的SAL浓度，计算累积释放率。释放动力学采用Korsmeyer-Peppas模型进行非线性回归分析。
动物实验使用野生型AB斑马鱼。首先评估了SAL、AKK和SAL@AKK对斑马鱼胚胎的生物相容性。随后，在成年斑马鱼中建立AHAI模型：将斑马鱼暴露于模拟海拔6000米环境中2小时。实验分为五组：对照组（CG）、AHAI组（HA 2h）、AHAI + SAL@AKK组、AHAI + SAL组和AHAI + AKK组。在暴露前24小时，对斑马鱼进行灌胃给药。暴露后，立即进行新鱼缸测试（NTT）行为学评估和氧化应激检测。采集头部组织用于检测炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）和氧化应激指标（ROS、MDA、GSH、SOD、CAT）。同时，取鳃和脑组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，进行组织病理学分析。
统计分析使用GraphPad Prism 8进行。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后使用Dunnett多重比较检验。p < 0.05被认为具有统计学显著性。
在结果与讨论部分，研究首先展示了通过真空辅助联结生成一个可行的益生菌递送系统（SAL@AKK）。未处理的AKK呈现完整的卵圆形形态。真空处理后，AKK（AKK V）表现出显著的表面皱缩，水动力尺寸从1593.2 nm降至996.5 nm，但Zeta电位基本不变。存活率显示，真空处理8小时内AKK仍保持相当活力（约49.5–62.0%），而10小时处理导致活力急剧下降。在0.5–10小时范围内评估SAL负载，包封率在4小时达到峰值（34.80%），随后下降。进一步测试显示，1 mg/mL和10 mg/mL的SAL浓度在4小时条件下负载均较少。优化条件（4小时）下制备的SAL@AKK保持了与AKK V相似的形态和活力，其水动力直径增加至1253.8 nm，Zeta电位接近AKK，表明SAL成功联结。综合考虑，4小时条件实现了高活力和最大包封率的双重优化。
其次，研究表征了SAL@AKK的体外释放行为和动力学。在模拟肠液中，SAL@AKK在最初1小时释放了7.23%的载荷，随后缓慢释放，24小时累积释放率为33.63%。使用Korsmeyer-Peppas模型拟合，释放指数n=0.57，表明其释放机制为扩散与细菌载体屏障特性随时间变化相关的非简单过程，支持其缓释特性。
第三，研究表明SAL@AKK缓解了AHAI相关的斑马鱼行为缺陷。AHAI暴露诱导斑马鱼运动和探索行为减少，僵直增加。SAL@AKK显著改善了这些行为表型，增加了总运动距离、平均速度和顶部区域穿梭频率，同时减少了僵直事件。相比之下，单独使用SAL或AKK仅产生部分改善。这表明SAL@AKK在对抗低氧相关行为损伤方面提供了优于单药治疗的功能性保护。
第四，研究表明SAL@AKK预防了AHAI诱导的氧化应激失衡。AHAI暴露显著扰乱了斑马鱼的氧化还原平衡。与AHAI组相比，SAL@AKK治疗显著降低了脂质过氧化产物MDA，提高了抗氧化能力（GSH），并恢复了酶防御活性（CAT和SOD）。流式细胞术ROS检测也证实了其抗氧化效果。SAL和AKK单独治疗仅产生适度的抗氧化改善，而SAL@AKK在多个氧化还原指标上实现了更广泛的恢复。
第五，研究表明SAL@AKK减轻了AHAI相关的炎症反应，并将炎症与氧化还原及行为学终点联系起来。AHAI诱导显著增加了斑马鱼头部组织中的促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）。SAL@AKK显著降低了这些细胞因子水平，其整体抗炎效果优于SAL或AKK单药治疗。通过热图、斯皮尔曼相关分析和主成分分析（PCA），整合了行为学参数、氧化应激指标和细胞因子水平。结果显示，抗氧化指标与促炎细胞因子呈强负相关，氧化损伤标志物与细胞因子水平呈正相关，表明在AHAI应激下氧化还原-炎症轴存在耦合关系。SAL@AKK治疗组在PCA空间中更接近对照组，表明其对AHAI紊乱的行为和生化参数有部分恢复的趋势。
最后，组织病理学证据支持SAL@AKK减轻了AHAI相关组织损伤，尤其是在鳃部。脑组织在各组间结构保存完好，未见显著差异。然而，作为气体交换直接参与器官且对缺氧敏感的鳃组织，在AHAI诱导后出现明显炎症细胞浸润。SAL@AKK显著减轻了这些炎症特征，定量分析显示其炎症浸润面积比例显著低于AHAI组。这些组织病理学改善与行为学和生化数据一致，表明SAL@AKK的保护作用延伸到了组织水平。
讨论部分指出，该研究主要依赖斑马鱼AHAI模型和短期组织学/生化终点。组织学量化样本量有限。尽管表面电荷和形态数据支持SAL与活体AKK的真空辅助联结，但未评估细胞内定位和体内肠道定植/药代动力学。虽然氧化应激指标和炎症细胞因子在SAL@AKK治疗后协同变化，但未获得特定信号通路的直接分子证据。未来研究应检查如NF-κB/NLRP3或Nrf2等相关通路以阐明机制。此外，本研究缺少热灭活AKK+SAL或空AKK V等额外对照组，未来应纳入这些组以更好地区分活细菌相关效应与载体相关贡献。
结论：本研究报道了SAL@AKK，一种通过真空辅助联结红景天苷（SAL）与Akkermansia muciniphila（AKK）生成的基于活体益生菌的递送平台。通过优化真空暴露以保持细菌活力并实现高效SAL联结，SAL@AKK在模拟肠道条件下表现出SAL的逐渐释放。在斑马鱼AHAI模型中，SAL@AKK提供了多层次保护，改善应激相关行为，恢复氧化还原稳态，抑制促炎细胞因子，并减少鳃部炎症损伤，其整体效果强于单独使用SAL或AKK。这些汇聚的功能、生化和组织学发现表明，协调的氧化还原-炎症轴可能参与SAL@AKK相关的保护作用，并凸显了与AKK的真空辅助联结是增强红景天苷以及其他短效天然化合物预防性能的实用途径。未来工作应量化体内肠道滞留、量效关系和通路介导因子，以促进在当前模型之外的转化研究。
