一种难以捕获的细菌氯甲烷脱卤酶系统的鉴定与表征

氯甲烷是一种主要由自然过程产生的有毒气体，并促进平流层臭氧破坏。厌氧乙酰生成菌脱卤乙酰杆菌（Acetobacterium dehalogenans）能够利用氯甲烷作为碳源和能源，但与之相关的脱卤酶/甲基转移酶此前一直未被明确鉴定。研究人员通过比较转录组学鉴定出一个基因簇cdmBCA，其编码一种依赖钴胺素（cobalamin）的甲基转移酶系统，该系统不同于已表征的、好氧甲基营养菌用于氯甲烷降解的Cmu系统。生物化学表征显示，Cdm系统可与其他卤代烷发生反应，但不同于亲缘关系较近的O-去甲基化酶（O-demethylases），其不作用于甲氧基化芳香化合物。蛋白质CdmB的X射线结构分析表明，其具有一个疏水性通道系统，可将卤代烷引导至依赖钴胺素的活化位点。同源蛋白存在于厌氧原核生物中，尤其见于厚壁菌门（Bacillota）和Asgardarchaeota，提示环境中可能存在此前未被识别的微生物氯甲烷转化过程。Cdm脱卤/甲基转移酶系统的发现，揭示了微生物对全球氯甲烷循环的贡献。

该论文发表于《Nature Communications》，围绕厌氧微生物氯甲烷（CM；CH₃Cl）转化这一长期悬而未决的问题展开。氯甲烷是大气中重要的卤代烃污染物和温室气体，既参与平流层臭氧破坏，也与气候变化密切相关。尽管自然界和人为活动均可释放氯甲烷，且已有研究认识到微生物降解是其环境去除的重要途径，但目前对相关酶学机制的认识明显偏向好氧体系。此前研究最充分的是好氧兼性甲基营养菌中的Cmu系统，而严格厌氧菌如何利用氯甲烷生长、其关键脱卤酶/甲基转移酶究竟为何，一直缺乏直接证据。脱卤乙酰杆菌（Acetobacterium dehalogenans）是最早被证明能够以氯甲烷作为碳源和能源生长的严格厌氧细菌之一，因此解析该菌中的氯甲烷转化机制，对于理解厌氧生态位中的卤代烃生物转化具有基础意义。

研究人员首先从生态与代谢背景出发，指出A. dehalogenans不仅能够利用氯甲烷，还可利用甲氧基化芳香化合物（MACs）生长，因此其基因组中含有大量潜在甲基转移酶系统。困难在于，究竟哪一套系统专门负责氯甲烷脱卤，长期未能被锁定。为解决这一问题，研究人员以丁香酸（syringate）、氯甲烷及其组合为底物，比较不同培养条件下的转录响应，发现一个由cdmB、cdmC和cdmA组成的基因簇在氯甲烷存在时显著上调。进一步结合异源表达、生化活性测定与结构生物学分析，研究人员证明该基因簇编码一种新的、依赖钴胺素的氯甲烷脱卤/甲基转移酶系统，命名为Cdm。该系统由底物特异性甲基转移酶I（MTI，methyltransferase I）CdmB、辅咕啉蛋白（CP，corrinoid protein）CdmC，以及甲基转移酶II（MTII，methyltransferase II）CdmA组成。研究表明，Cdm系统在组成、底物谱和潜在催化机制上均明显不同于已知的Cmu系统。

从方法学上看，研究的关键技术主要包括三部分。其一，基于A. dehalogenans不同底物条件培养样本的比较转录组测序（RNA-seq），筛选氯甲烷诱导表达的候选基因簇。其二，在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达CdmB、CdmC及活化酶（AE，activating enzyme），结合紫外-可见吸收光谱（UV-vis）、酶动力学和底物谱分析，进行体外功能鉴定。其三，通过X射线晶体学解析CdmB结构，并结合AlphaFold 3复合体建模、系统发育分析和基因邻域比较，阐明其底物通道特征、潜在作用机制及系统的进化分布。

Enhanced expression of genes encoding a corrinoid-dependent methyltransferase system (Cdm) in A. dehalogenans upon exposure to chloromethane

研究人员首先比较了A. dehalogenans在丁香酸、氯甲烷以及二者共存条件下的生长和转录特征。结果显示，该菌能够同时代谢丁香酸和氯甲烷，说明其对两类甲基供体并无明显偏好，也未观察到底物间对脱卤酶表达的强烈抑制。比较转录组学进一步显示，与丁香酸条件相比，氯甲烷条件下大量基因发生差异表达，其中一个由ACIUZZ_RS16855、ACIUZZ_RS16850和ACIUZZ_RS16845组成的基因簇显著上调。该基因簇分别编码MTI、CP和MTII，被命名为cdmBCA。与此同时，氯甲烷生长条件下还观察到氯离子转运、应激反应和毒素-抗毒素系统相关基因上调，而能量代谢与合成代谢相关基因下调，提示氯甲烷对细胞具有应激和抑制效应。综合表达模式，研究人员将cdmBCA确定为最有可能介导氯甲烷转化的候选系统。

The CdmBC proteins exhibit high activity with chloromethane

在功能验证部分，研究人员异源表达并纯化了CdmB和CdmC，同时利用A. dehalogenans中此前已表征的ATP依赖性辅咕啉活化酶（AE）将CdmC上的Co(II)-钴胺素还原为活性Co(I)状态。UV-vis结果显示，AE介导Co(II)-CdmC向Co(I)-CdmC转变后，加入CdmB和氯甲烷，可进一步形成CH₃-Co(III)-CdmC，这说明CdmBC复合体系能够完成氯甲烷脱卤后甲基向辅因子的转移。由于CdmA未能成功在E. coli中制备，其催化四氢叶酸（H₄F）甲基化的过程未被直接实验证实，但结合既往细胞提取液研究和结构预测，研究人员认为CdmA极可能负责将甲基转移至H₄F。

酶学实验表明，Cdm系统对氯甲烷具有较高活性，CdmB存在时Co(III)-CdmC形成的比活性为3.9 ± 0.5 µmol·min⁻¹·mg⁻¹。EDTA或ZnCl₂处理不影响该活性，说明催化不依赖锌，这一点使其区别于部分含锌O-去甲基化酶。进一步的底物谱分析显示，Cdm系统还能与二氯甲烷（DCM）、碘甲烷、碘乙烷、溴乙烷、1-溴丙烷和1-溴丁烷发生反应，但对1-氯丙烷和1-溴戊烷无反应；同时，它不作用于MACs、甲氧基化/甲基化醇、二甲基二硫和甲胺类，突出了其对卤代烷的专一性。动力学分析显示，CdmB对氯甲烷的K_m为2.9 mM，V_max为4.8 µmol·min⁻¹·mg⁻¹，k_cat为3.8 s⁻¹；对二氯甲烷的K_m高达68.7 mM，而V_max相近，说明该酶对二氯甲烷的识别和结合效率明显较低。培养实验进一步证明，二氯甲烷会抑制A. dehalogenans在氯甲烷上的生长，提示其虽可作为体外反应底物，却可能并非生理相关底物，反而可能通过不可逆影响CdmC而抑制系统功能。

The methyltransferase CdmB features a substrate channel network that directs small haloalkanes to the cobalt ion within CdmC

为理解底物识别与催化基础，研究人员解析了CdmB的晶体结构，分辨率达到1.57 Å。CdmB形成同源二聚体，核心为TIM桶（TIM barrel）结构，并在前几段β折叠之间具有扩展区。这些扩展区不仅参与二聚化，还构成蛋白内部的疏水核心与通道网络，将蛋白表面与中心空腔连接起来。结构中未观察到明显金属离子，包括结晶前加入的Zn²⁺，这与酶学结果一致，支持CdmB并非锌依赖型甲基转移酶。

在二氯甲烷和碘甲烷浸泡晶体后，研究人员在疏水通道内观察到多个卤代烷结合位点，证明这些小分子可沿着专门的疏水路径扩散至中心区域。结合AlphaFold 3对CdmBC复合体的建模，研究人员提出，CdmC中携带钴胺素的Rossmann折叠结构域可嵌入CdmB中央疏水腔附近，使Co(I)-B₁₂位于底物通道出口附近，从而有利于对卤代烷底物实施亲核攻击。虽然当前模型仍存在空间位阻，尚不能完全精确定位辅咕啉，但整体结构证据清晰支持一种“底物导流—辅因子活化”模式，即CdmB更像一个底物选择性支架（scaffold），而非直接执行化学催化的活性中心。

The Cdm methyltransferase system exhibits an evolutionary history with homologues predominantly encoded by Bacillota and Asgardarchaeota

系统发育分析显示，CdmB属于尿卟啉原III脱羧酶（UroD）超家族，该超家族中既包含O-去甲基化酶，也包含卤代烷脱卤相关酶。CdmB与若干作用于MACs的MTI蛋白如MtvB、OdmB、VdmB同属相关分支，但其底物特异性明显偏向卤代烷；它与古菌O-去甲基化酶MtoB亲缘较近，却在功能上显著分化。与此相比，另一类已知卤代烷脱卤甲基转移酶如CmuA、MecE和MecC则在该超家族中更早分出，说明卤代烷转化能力在这一蛋白家族中可能经历了多次独立演化。

基因组筛查和系统完整性分析还发现，cdm样系统广泛存在于厌氧原核生物中，尤其集中于厚壁菌门和Asgardarchaeota。若干与CdmB高度同源的蛋白存在于已知可降解卤代烷的菌株中，但其具体功能尚未被表征。此外，在Sigynarchaeales目古菌中也发现了Cdm同源基因，提示古菌也可能具备卤代烷转化潜力。这些结果显著扩展了研究人员对厌氧卤代烷代谢生态分布的认识。

讨论部分指出，本研究首次明确鉴定出A. dehalogenans中的氯甲烷脱卤系统Cdm，并证明其不同于此前唯一被充分表征的Cmu系统。Cdm由MTI、CP和MTII三组分构成，整体上更接近典型辅咕啉依赖型甲基转移酶体系，但其底物却是卤代烷而非甲氧基化芳香化合物。CdmB虽与O-去甲基化酶在系统发育上相近，却不催化MACs去甲基化，这反映出显著的功能分化。其结构特征进一步说明，该蛋白的关键作用可能在于通过疏水通道筛选并输送底物，使之到达CdmC中的钴胺素反应位点，而不是像经典酶活性中心那样直接参与断键成键过程。研究还指出，Cdm对二氯甲烷和较长链卤代烷的体外反应，很可能会生成无法进一步进入代谢的烷基-钴中间体，从而导致系统抑制，因此这些反应未必具有生理意义。

研究结论部分可概括为：本研究揭示了一种甲基转移酶系统Cdm，该系统特异性催化氯甲烷等卤代烷脱卤，并在组成、活性和底物谱方面显著区别于已表征的氯甲烷脱卤酶Cmu。CdmB的结构为参与卤代烷脱卤的甲基转移酶提供了结构层面的认识。与其他已表征甲基转移酶不同，CdmB很可能主要充当底物选择性支架，通过疏水网络将底物导向钴胺素辅因子，而不是直接参与催化。尽管CdmB与O-去甲基化酶亲缘接近，该甲基转移酶并不转化甲氧基化芳香化合物，且可能经历了不同的进化历程。研究结果提示，Cdm系统很可能局限于厌氧微生物，因为cdmB样基因主要编码于厚壁菌门厌氧成员及以厌氧古菌为主的Asgardarchaeota中。Asgardarchaeota中cdmB基因的存在表明，古菌也可能具有转化卤代烷的遗传潜力，从而拓展了对微生物卤代烷代谢的理解。