摘要：本研究利用α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase，AFU）响应型荧光探针HD-AFU（含经典AFU识别基团及结构优化的半花菁-硫氧杂蒽信号单元），实现了肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）与急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的检测。与近期报道的探针相比，HD-AFU在HCC及AKI模型中监测AFU活性表现出稳定可靠性能，可线粒体靶向细胞内成像以追踪病程进展及治疗干预中AFU动态变化；在原位移植瘤小鼠模型中能清晰可视化HCC状态。为验证探针检测AKI中AFU的准确性，研究人员建立顺铂诱导、庆大霉素诱导、高尿酸肾病及糖尿病肾病四种AKI模型（模型准确构建对后续荧光成像研究具有重要意义），并以氯沙坦治疗高尿酸肾病、二甲双胍治疗糖尿病肾病，利用探针完成治疗药物筛选与验证；在长期诱导并经血清学指标及组织病理学评估确认的HCC与AKI模型中，HD-AFU成功可视化诊断及药物治疗过程。本研究为开发有效诊断策略提供了有价值的参考。
论文解读：利用α-L-岩藻糖苷酶(AFU)监测近红外荧光探针实现肝细胞癌与急性肾损伤精准诊断
该研究发表于《Analytica Chimica Acta》。
一、研究背景与立项依据
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是癌症相关死亡的主要病因之一，早期准确诊断率低是导致其预后差的重要原因。临床常规标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）特异性不足；血清α-L-岩藻糖苷酶（α-L-fucosidase, AFU）在HCC患者血清中升高，与肝癌发生发展各阶段密切相关，可作为潜在替代或补充生物标志物，且可用于评估HCC治疗效果。急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）传统标志物血肌酐（serum creatinine, sCr）和尿量变化滞后且缺乏肾小管损伤特异性，尿AFU作为溶酶体外糖苷酶，在肾小管上皮细胞受损时释放入尿液，其活性升高早于sCr，是反映肾小管损伤的潜在早期预警标志物。现有AFU检测方法多为生化比色或化学发光，缺乏活体、实时、可视化近红外（near-infrared, NIR）成像工具。既往报道的AFU荧光探针在稳定性、近红外发射及活体成像性能方面仍有局限。因此研究人员设计并合成了一种新型AFU响应型近红外荧光探针HD-AFU，旨在实现对HCC与AKI的NIR荧光成像诊断及对药物治疗响应的可视化评估。
二、主要关键技术方法
研究人员设计合成了以α-L-呋喃果糖苷键为AFU识别单元、结构修饰的半花菁-硫氧杂蒽（hemicyanine-thioxanthene）为信号报告基团的探针HD-AFU；通过核磁、质谱表征结构。在细胞水平利用HCC细胞及肾近曲小管上皮细胞进行AFU过表达/抑制验证、线粒体共定位、细胞毒性（CCK-8）及AFU酶动力学测定。动物实验采用BALB/c裸鼠原位HCC移植瘤模型；AKI模型包括顺铂（cisplatin）诱导、庆大霉素（gentamicin）诱导、高尿酸血症肾病（hyperuricemic nephropathy）及糖尿病肾病（diabetic nephropathy, db/db小鼠）四种，部分予以氯沙坦（losartan）或二甲双胍（metformin）干预；长期诱导HCC与AKI模型经血清生化（ALT/AST/BU/Cr等）及组织病理（H&E、Masson、AFU免疫组化）确认后行活体及离体NIR荧光成像（Ex 680 nm / Em 712 nm）。探针选择性通过常见氨基酸、离子及生物分子干扰实验验证。
三、研究结果
Materials（材料与探针合成与表征）
研究人员通过氰碱衍生物合成、环化构建硫氧杂蒽骨架、与糖苷键衍生淬灭基团偶联三步获得HD-AFU（合成路线见Scheme S1），经1H NMR、13C NMR及HR-MS确证结构。探针在AFU存在下糖苷键断裂，恢复NIR荧光（最大激发≈680 nm，发射≈712 nm），溶液pH 6.5–8.0内稳定。
Result and discussion（结果与讨论——光谱性质、选择性及酶动力学）
体外实验表明HD-AFU对AFU表现出高选择性，常见氨基酸、金属离子、其他水解酶（如β-葡萄糖醛酸酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NAG）无明显响应；AFU催化HD-AFU水解呈时间-浓度依赖性，米氏常数Km及Vmax符合典型米氏动力学，检出限低，信噪比优于已报道AFU探针。探针低细胞毒性（IC50＞50 μM），与线粒体染料共定位系数高，证实线粒体靶向能力。
Result and discussion（细胞水平AFU动态监测）
在HCC细胞及氧化损伤/药物处理的肾小管上皮细胞中，HD-AFU荧光强度随AFU活性上调（肿瘤或损伤状态）增强，AFU抑制剂可显著降低信号，可实时追踪细胞进程中AFU活性变化，并能区分不同药物处理下的细胞响应差异。
Result and discussion（原位HCC移植瘤模型成像）
裸鼠原位HCC移植瘤模型尾静脉注射HD-AFU后，肿瘤区域出现强NIR荧光信号，对照正常肝组织信号弱；与肿瘤体积及组织AFU免疫组化阳性程度正相关，说明探针可无创可视化HCC病灶。
Result and discussion（四种AKI模型及药物疗效评价）
在顺铂、庆大霉素、高尿酸肾病及db/db糖尿病肾病四种AKI模型中，肾脏及尿液中HD-AFU荧光信号均显著高于对照组，且与肾组织AFU活性、尿NAG及肾小管损伤程度相符。氯沙坦干预高尿酸肾病模型、二甲双胍干预糖尿病肾病模型后，荧光信号减弱至接近假手术组水平，提示探针可反映药物对肾小管损伤的治疗改善效果。
Result and discussion（长期诱导HCC与AKI模型验证）
经血清生化指标（HCC：ALT、AST升高；AKI：BUN、Scr升高）及组织病理（HCC异型增生、AKI近曲小管坏死/空泡变性）确认的长期诱导模型中，HD-AFU可分别清晰显示肝脏肿瘤区域及受损肾脏的高荧光信号，并在相应药物治疗后信号下降，验证了其在复杂病理状态下诊断及疗效监测的适用性。
四、结论（Conclusions部分翻译/总结）
综上所述，本研究成功构建了基于AFU响应型近红外荧光探针HD-AFU的HCC与AKI NIR荧光成像检测方法。HD-AFU融合经典糖苷键识别单元与结构优化的半花菁-硫氧杂蒽信号支架，相较近期报道探针在生物模型中监测AFU活性表现更稳健可靠。该探针对线粒体具靶向性，可在细胞水平有效追踪AFU动态变化；于原位HCC移植瘤模型及四种AKI模型中均能清晰可视化疾病状态，并可基于荧光强度比较不同治疗方案效果。该新型荧光检测工具有望为HCC与AKI的早期诊断及精准治疗评估提供有价值的新策略，也为以酶为靶点的其他蛋白质组学生物标志物探针开发提供参考。
