摘要：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化道常见恶性肿瘤，其发病率与死亡率逐年上升，寻找CRC新治疗靶点成为当务之急。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）与CRC进展密切相关。本研究表明，TME中单核细胞可分泌白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β），后者可增强结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。同时，IL-1β可激活p65，导致角蛋白7（keratin 7, KRT7）表达上调，KRT7进一步结合整合素α1亚基（integrin subunit alpha 1, ITGA1）激活整合素连接激酶（integrin-linked kinase, ILK），促进CRC发生上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）。ILK活性增强并诱导p65磷酸化水平升高，进而进一步促进KRT7表达，从而形成正反馈环路促进CRC的发生与发展。
本研究论文发表于《Genes & Diseases》（原文未明确标注期刊名，按用户要求填写）。
论文解读
研究背景与立题依据
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，复发及转移性CRC患者5年生存率不足13%，现有治疗手段疗效有限，亟需发掘新的分子靶点与干预策略。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的炎性介质可通过信号转导促进肿瘤进展，白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）是由单核/巨噬细胞分泌的关键促炎细胞因子，在多种肿瘤中被证实具促癌作用，但其调控CRC进展的具体分子机制尚不清楚。核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）p65亚基可被IL-1β激活并入核启动异常转录；角蛋白7（keratin 7, KRT7）在多种肿瘤中高表达并可促进上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）；整合素α1亚基（integrin subunit alpha 1, ITGA1）与整合素连接激酶（integrin-linked kinase, ILK）参与整合素介导的信号转导及EMT过程，但KRT7–ITGA1–ILK轴是否及如何介导CRC的EMT尚待阐明。本研究旨在明确TME中单核细胞来源IL-1β促进CRC进展的分子机制，并验证p65–KRT7–ILK正反馈环路的存在及其生物学功能。
主要关键技术方法
研究人员收集重庆医科大学附一院2022年10月至2023年3月行根治性手术的94例CRC患者癌组织及配对癌旁正常组织（经伦理审批且获知情同意），同时构建人CRC细胞系HCT116、HCT8及THP-1单核细胞共培养体系，利用CRISPR-Cas9构建基因敲除细胞系、siRNA及过表达质粒进行细胞功能挽救实验。主要技术手段包括：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测组织及血清IL-1β水平；流式细胞术分选CRC组织浸润免疫细胞；Western blotting及免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）检测蛋白表达、磷酸化及相互作用；切割锚定并转座测序（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）与双荧光素酶报告基因检测p65对KRT7启动子的结合与转录激活；邻近连接 assay（proximity ligation assay, PLA）验证蛋白互作；体外细胞计数盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）、克隆形成、Transwell、划痕愈合及凋亡检测评估细胞增殖、迁移、侵袭与凋亡；体内构建CRC患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）小鼠模型及脾–肝转移模型，予以外源性IL-1β或IL-1受体拮抗剂阿那金拉（Anakinra）干预，评估体内成瘤与转移能力及Ki-67免疫组化染色。
研究结果
IL-1β is up-regulated in CRC and associated with clinicopathological features
研究人员通过血清细胞因子筛查发现CRC患者血清IL-1β显著升高，结合TCGA及GEO数据库分析、Western blotting、免疫组化（immunohistochemistry, IHC）及ELISA检测94对CRC/癌旁组织，证实IL-1β在CRC组织中明显高表达，且其表达水平与肿瘤大小、T分期及淋巴结转移状态正相关；受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线及生存分析显示IL-1β可作为CRC诊断及预后判断指标。
IL-1β is mainly secreted by monocytes in the tumor microenvironment and promotes the proliferation, invasion, and migration of CRC cells in vitro
基于单细胞测序（GSE200997）注释及流式分选CRC组织免疫细胞，经PCR与Western blotting确认IL-1β主要由TME中单核细胞分泌（与CD14共定位）。THP-1与CRC细胞共培养及外源性IL-1β干预实验表明，IL-1β结合CRC细胞表面IL-1受体1（interleukin-1 receptor type 1, IL-1R1）后显著促进HCT116及HCT8细胞增殖、迁移与侵袭，并抑制凋亡；IL-1R1基因敲除或Anakinra处理可逆转上述效应。
IL-1β promotes KRT7 expression through p65
IL-1β刺激使IκBα（inhibitor of κB α）、IKKα（IκB kinase α）及p65（Ser536）磷酸化水平升高，促进p65入核；RNA测序与质谱交集筛选发现KRT7显著上调，IL-1β以转录水平上调KRT7蛋白表达（放线菌酮可阻断该上调）；CUT&Tag与双荧光素酶报告实验证实活化的p65直接结合KRT7启动子区转录起始位点上游转录结合位点1（transcription factor binding site 1, TBS1）并激活其转录。
IL-1β could promote the proliferation, invasion, and migration of CRC cells by activating p65 to enhance KRT7 expression
CRC组织中IL-1β与KRT7蛋白表达呈正相关。敲低KRT7削弱IL-1β促增殖、迁移及侵袭作用，过表达KRT7增强之；于KRT7敲低细胞中回补KRT7或在过表达细胞中再敲低KRT7可分别恢复或抵消IL-1β介导的表型改变。阻断IL-1R后用p65过表达可挽救被抑制的细胞功能，证明IL-1β经p65→KRT7轴驱动CRC恶性表型。
KRT7 binds to ITGA1 to activate ILK, leading to the occurrence of EMT in CRC cells, and ILK activation could enhance the phosphorylation state of p65
Co-IP联合质谱鉴定KRT7互作蛋白富集于黏着斑通路，包括ITGA1与ILK；PLA及免疫荧光证实KRT7与ITGA1直接结合，KRT7表达高低正向调控ITGA1–ILK结合强度。IL-1β处理下调上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）并上调间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin），诱导EMT；该诱导效应可被KRT7敲低部分逆转。体外激酶实验及Co-IP证实ILK可与p65形成复合物并直接磷酸化p65 Ser536，ILK特异性抑制剂ILK-IN-3可抑制p65磷酸化及核转位，表明ILK反馈激活p65，构成p65↑→KRT7↑→KRT7–ITGA1–ILK复合体↑→ILK磷酸化p65 Ser536↑的正反馈环路。
IL-1β promoted the proliferation and metastasis of CRC cells in vivo
PDX模型予腹腔注射IL-1β（1000 ng/kg）或Anakinra（50 mg/kg），结果显示IL-1β促进移植瘤体积增大、质量增加及Ki-67高表达，Anakinra抑制之；脾注射HCT8细胞建立肝转移模型，IL-1β组肝转移结节增多，Anakinra组减少，证实IL-1β在体内同样促进CRC生长与转移。
讨论与结论
讨论部分指出本研究明确了TME单核细胞来源IL-1β在CRC中的促癌作用及具体分子机制：IL-1β经IL-1R激活NF-κB p65入核，转录上调KRT7；KRT7结合ITGA1激活ILK，ILK作为丝氨酸/苏氨酸激酶直接磷酸化p65 Ser536促其入核，形成p65–KRT7–ILK正反馈环路，最终驱动EMT及CRC进展。该环路为CRC提供了潜在的新型诊断标志物（IL-1β、KRT7）及治疗靶点（IL-1β/IL-1R、ILK），Anakinra及ILK抑制剂在本研究中显示出抑癌效果。作者亦指出尚需明确环路中单一靶点阻断的治疗价值及单核细胞内IL-1β上调的机制。
结论翻译（浓缩自原文Conclusion）：
IL-1β在CRC组织中过表达，可作为CRC重要预测因子及预后指标。TME中单核细胞为主要IL-1β分泌源，IL-1β促进CRC细胞增殖、侵袭与迁移。机制上，IL-1β激活p65并上调KRT7表达，KRT7结合ITGA1激活ILK从而促进CRC上皮–间质转化；活化的ILK增强p65磷酸化并进一步上调KRT7，形成p65–KRT7–ILK正反馈环路驱动CRC进展。
