摘要背景：犊牛腹泻是奶牛养殖中一项普遍且严重的挑战。虽然药用植物在无抗养殖体系中展现出预防犊牛腹泻的巨大潜力，但其活性成分及作用机制仍不甚明了。本研究旨在通过综合网络药理学、代谢组学和微生物组学的方法，探究一种多味草药混合物（PM；包含山楂、裸花紫珠、白背叶、阳春砂、积雪草及益智仁）对4日龄至60日龄哺乳期犊牛的干预作用。结果：日粮中补充40 g/d的PM可显著降低腹泻发生率（P < 0.05），提高单核细胞水平（P < 0.05），并改善空肠绒毛高度（P < 0.05）。网络药理学预测显示，IL6、EGFR、SRC、TP53和CCND1是关键靶点，而金合欢素（acacetin）、白杨素（chrysin）、白杨素甲醚（tectochrysin）、二氢青蒿酸（dihydroartemisinic acid）及石吊兰素（lysinotin）可能是潜在的活性成分。血清代谢组学揭示，PM补充显著富集了类固醇激素生物合成途径。同时，PM改变了胃肠道微生物群，增加了瘤胃中Mediterranea massiliensis、Prevotella denticola、Duncaniella freteri以及粪便中Clostridium nexile的丰度，并降低了粪便中Blautia producta、Vescimonas fastidiosa及Alistipes putredinis的丰度（P < 0.05）。结论：综合这些发现表明，PM补充可能通过重塑血清类固醇激素生物合成以及改善瘤胃和粪便微生物群组成，从而缓解犊牛腹泻。金合欢素、白杨素、白杨素甲醚、二氢青蒿酸及石吊兰素可能是潜在的活性成分。
研究背景显示，犊牛腹泻是全球奶牛业公认最普遍且最严重的疾病之一，可导致高死亡率、生长迟缓以及长期生产性能受损，给行业带来巨大经济损失。尽管抗生素治疗仍是管理犊牛腹泻的主要临床策略，但长期或不加区分的使用会导致耐药性产生并破坏肠道微生物群，可能加剧健康和环境挑战。因此，开发安全、有效且可持续的抗生素替代品已成为畜牧业的当务之急。药用植物的研究揭示了其作为管理犊牛腹泻的可行抗生素替代品的潜力，但草药制剂的药理学表征仍面临挑战，其复杂的多成分特性和多药理学特性使得使用传统的单靶点实验模型难以全面阐明其活性成分和作用机制。现有研究大多集中在表型结果上，而对它们如何影响活性成分和信号通路的系统性研究仍然有限。
研究人员开展了一项集成多组学方法的研究。首先，根据中药兽医学（TCVM）的“君臣佐使”理论，设计了一种由六种等比例药用植物组成的PM，并在哺乳期犊牛日粮中补充。研究选用了64头健康荷斯坦犊牛，随机分为对照组和三个不同剂量的PM补充组。在整个实验期（4日龄至60日龄），研究人员监测了粪便评分、血液学参数，并在60日龄时采集了血清、瘤胃液、粪便样本以及胃肠道组织样本，进行了包括组织形态学分析、血清药物化学、非靶向代谢组学和16S rRNA测序在内的综合分析，并通过网络药理学和分子对接进行机制预测。研究得出的结论是，每日补充40 g PM能通过调节血清类固醇激素生物合成以及增强瘤胃和粪便的微生物多样性，有效缓解犊牛腹泻。金合欢素、白杨素、白杨素甲醚、二氢青蒿酸和石吊兰素可能作为潜在的活性成分发挥作用。这项研究为草药及其提取物在反刍动物中的应用提供了理论基础，相关成果发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》上。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：网络药理学，用于预测PM缓解腹泻的潜在活性成分、核心靶点及富集通路；基于超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）的非靶向代谢组学，用于分析血清代谢物谱的变化；以及基于16S rRNA基因测序的微生物组学，用于解析瘤胃液和粪便微生物群的组成与多样性。研究样本队列来源于64头健康的荷斯坦犊牛。
研究结果部分包含多个小标题，简要说明如下：
在腹泻发生率方面，通过逻辑回归模型分析粪便评分数据得出，与对照组相比，补充40 g/d PM显著降低了犊牛发生腹泻（粪便评分≥ 3）的概率。
在血液学参数方面，通过全自动血液细胞分析仪检测得出，PM补充，特别是40 g/d剂量，显著提高了单核细胞浓度，白细胞浓度也有边际显著性提高，而其他参数未受显著影响。
在胃肠道形态学评估方面，通过组织切片H&E染色和显微镜测量得出，PM40组空肠绒毛高度显著高于对照组，表明PM可能促进了肠道黏膜的修复与发育。
在入血成分分析方面，通过血清药物化学分析得出，在PM40组犊牛血清中检测到22种源自PM的原型化合物，主要包括萜类和黄酮类物质。
在网络药理学分析方面，通过构建“成分-靶点-疾病”网络和PPI网络，并进行KEGG通路富集分析得出，IL6、EGFR、SRC、TP53和CCND1是关键靶点，PI3K/AKT信号通路是显著富集通路，金合欢素、白杨素、白杨素甲醚、二氢青蒿酸及石吊兰素被识别为核心活性成分。
在分子对接方面，通过计算验证得出，上述五种核心活性成分与五个关键靶蛋白（CCND1、TP53、IL6、EGFR、SRC）均具有良好的结合亲和力（结合能 < -5 kcal/mol）。
在血清代谢组学分析方面，通过OPLS-DA和代谢通路富集分析得出，PM40组与对照组代谢物谱显著分离，差异代谢物主要富集在类固醇激素生物合成途径，且2-甲氧雌酮-3-葡萄糖醛酸苷、雌酮葡萄糖醛酸苷和睾酮葡萄糖醛酸苷等代谢物水平显著上调。
在瘤胃微生物组分析方面，通过16S rRNA测序和LEfSe分析得出，PM40组瘤胃微生物群的α多样性（Chao和ACE指数）显著增加，并且显著富集了Mediterranea massiliensis、Prevotella denticola和Duncaniella freteri等纤维降解相关细菌。
在粪便微生物组分析方面，通过16S rRNA测序和LEfSe分析得出，PM40组粪便微生物群的α多样性同样显著增加，Clostridium nexile丰度显著升高，而Blautia producta、Vescimonas fastidiosa和Alistipes putredinis丰度显著降低。
在相关性分析方面，通过Spearman相关性分析得出，入血活性成分（如金合欢素）与差异代谢物之间，以及差异代谢物与瘤胃/粪便差异微生物之间存在显著的相关性网络，提示PM可能通过调控微生物群落来影响宿主代谢。
讨论部分总结指出，本研究证实了PM补充能够通过调节胃肠道微生物群落结构和血清类固醇激素合成来缓解犊牛腹泻。研究结果为PM的抗腹泻作用提供了多层面的证据：在生理指标上表现为腹泻减少和空肠绒毛形态改善；在分子机制上指向PI3K/AKT信号通路的潜在调控和类固醇激素生物合成的重塑；在物质基础上则锁定了五种核心活性成分。然而，研究也承认了若干局限性，包括代谢组和微生物组分析仅在实验终点进行，未能捕捉动态变化；缺乏阳性对照组以比较PM与其他干预措施的疗效；以及网络药理学预测结果需要后续直接的实验验证。这些发现为未来开发草药混合物作为犊牛饲养中潜在替代策略提供了理论依据。
研究结论部分翻译如下：本研究表明，日粮补充PM（40 g/d）可显著降低哺乳期犊牛的腹泻发生率并改善空肠绒毛形态。综合的血清代谢组、瘤胃和粪便微生物组分析表明，这些有益效应可能与重塑类固醇激素生物合成以及优化瘤胃和粪便微生物群落有关。网络药理学揭示，金合欢素、白杨素、白杨素甲醚、二氢青蒿酸及石吊兰素可能是潜在的活性成分。这些发现为未来开发草药混合物作为犊牛饲养中常规干预措施的潜在替代品提供了理论基础，尽管所提出的作用机制和关键活性成分仍需进一步的实验验证。
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