摘要：铜死亡(Cuproptosis)是2022年新发现的一种铜依赖性调节性细胞死亡(Regulated Cell Death, RCD)途径，由线粒体中脂酰化蛋白聚集驱动，在癌症治疗中具较大潜力。其临床转化受游离铜离子脱靶毒性、线粒体靶向递送不足及免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)制约。研究人员开发了一种透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)伪装、pH响应的纳米平台HACCR，用于线粒体靶向铜死亡驱动协同治疗与系统性抗肿瘤免疫激活。该纳米平台内核通过铜-二甲双胍碳点(Copper-Metformin Carbon Dots, CuMCDs)与免疫佐剂R837经由π–π堆积自组装形成无载体纳米结构，CuMCDs载量43.6%、R837载量35.2%。水热法合成的CuMCDs具有固有线粒体靶向性，可将铜精准递送至铜死亡起始位点并放大通路激活；其在808 nm激光下具高效光热转换能力，直接诱导肿瘤细胞死亡同时增强铜死亡、化学动力学治疗(Chemodynamic Therapy, CDT)及免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)。HA-肉桂醛(Cinnamaldehyde, CA)胶束壳层通过CD44介导的肿瘤靶向及酸性TME响应性释药降低脱靶效应。体外与体内评价证实其可有效诱导铜死亡、逆转免疫抑制TME、促进树突状细胞(Dendritic Cell, DC)成熟及T细胞浸润。联合抗PD-L1免疫检查点阻断后，HACCR可实现原发瘤根除及远端转移抑制且具良好全身生物安全性。本研究建立了一种适用于铜死亡基协同癌症免疫治疗的通用纳米平台，为铜依赖性细胞死亡策略的临床转化提供参考。
研究背景与意义
铜死亡(Cuproptosis)是2022年新确认的一种铜依赖性调节性细胞死亡(Regulated Cell Death, RCD)方式，依赖于三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle, TCA Cycle)中线粒体脂酰化蛋白聚集及随后的蛋白毒性应激，且不依赖Caspase激活，为克服肿瘤凋亡抵抗提供了新思路。然而铜死亡疗法的临床转化面临三大瓶颈：游离铜离子(尤其是Cu2+ /Cu+ )全身给药存在严重脱靶毒性和肿瘤富集不足；铜离子难以高效递送至线粒体——铜死亡的核心发生场所；肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中高水平谷胱甘肽(Glutathione, GSH)螯合铜离子并清除活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，削弱铜死亡与化学动力学治疗(Chemodynamic Therapy, CDT)效果，且缺氧及免疫抑制TME限制系统性抗肿瘤免疫反应及远端转移抑制。针对上述局限，牡丹江医学院Hui Zhang、Yuting Lu等研究人员设计并构建了一种HA伪装、pH响应的线粒体靶向纳米平台HACCR（Hyaluronic Acid-Cinnamaldehyde encapsulated CuMCDs@R837），实现铜死亡驱动的光热/化学动力学协同治疗与系统性免疫治疗。研究证明HACCR可高效靶向线粒体诱导铜死亡，耗竭GSH、产生ROS与O2 缓解缺氧，触发免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)并重塑免疫抑制TME，联用抗PD-L1可同时抑制原发灶与远端转移灶，且具良好生物相容性。该研究成果发表于《Materials Today Bio》。
主要关键技术方法
研究人员采用一锅水热法以醋酸铜、盐酸二甲双胍及1,8-萘二甲酸酐为前体制备铜掺杂二甲双胍碳点(CuMCDs)；通过π–π堆积将CuMCDs与TLR7激动剂R837自组装为无载体CuMCDs@R837纳米复合物；以EDC/NHS催化HA与肉桂醛(CA)缩合制备含希夫碱(Schiff Base)键的pH响应性HA-CA共轭物，再包封CuMCDs@R837形成HACCR纳米粒。利用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、X射线衍射(XRD)、拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、Zeta电位、X射线光电子能谱(XPS)、紫外-可见-近红外吸收光谱(UV-vis-NIR)及荧光光谱进行理化表征；以电子自旋共振(ESR)检测•OH生成，二硝基苯肼法评估GSH耗竭及溶氧探针测O2 生成验证CDT与抗氧化耗竭功能；通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察CD44介导摄取及线粒体共定位(Pearson相关系数)；CCK-8法测细胞活力，活/死细胞染色、JC-1探针测线粒体膜电位(ΔΨm)、Western Blot(WB)及免疫荧光检测铜死亡标志蛋白(FDX1、LIAS、DLAT聚集)、ICD标志(CRT、HMGB1、ATP外排)及HIF-1α/VEGF/PD-L1通路；流式细胞术分析树突状细胞(DC2.4)成熟(CD80+ CD86+ )及巨噬细胞(Raw264.7)M2-to-M1极化(CD86+ CD206low )、肿瘤浸润CD4+ /CD8+ T细胞；建立Balb/c小鼠皮下双侧CT26结肠癌细胞移植瘤模型（原发+远端），尾静脉注射给药，808 nm激光照射，联用腹腔注射αPD-L1，监测肿瘤体积、体重；活体荧光/光热成像评估肿瘤靶向与蓄积；取主要脏器行H&E染色、血生化及ICP-MS测铜代谢进行生物安全性评价。
研究结果
2.1. Design and Synthesis of the HACCR Nanoplatform
研究人员依次合成约5 nm球形CuMCDs（含Cu(I)/Cu(II)共存态）、经π–π堆积组装CuMCDs@R837、通过希夫碱键修饰HA-CA并包封形成平均粒径约140 nm具核壳结构的HACCR。HA壳层介导CD44主动靶向及EPR效应富集于肿瘤，酸性TME中希夫碱断裂释放CuMCDs@R837，CuMCDs因固有线粒体靶向性将铜递送至线粒体诱发脂酰化蛋白聚集启动铜死亡。
2.2. Physicochemical Characterization of the Nanoplatform
TEM显示CuMCDs~5 nm球形，HACCR~140 nm核壳；DLS与Zeta电位变化证实逐层组装成功（CuMCDs正电→CuMCDs@R837正电→HACCR负电）；XPS检出C、N、O、Cu元素及Cu 2p双价态；UV-vis-NIR证实808 nm强吸收及CuMCDs本征荧光（HACCR因聚集荧光淬灭利于光热转换）；EDS元素映射显示Cu均匀分布于HACCR中，表明成功包封。
2.3. pH-Responsive Performance and Colloidal Stability
HACCR在pH 7.4生理条件下48 h内结构稳定、药物缓释少；pH 5.5酸性条件希夫碱水解致胶束解离，CuMCDs与R837随时间依赖性加速释放。HACCR在生理盐水、pH 7.4缓冲液及含血清培养基中7天粒径、电位、吸光度无明显变化，证实良好胶体稳定性。
2.4. Photothermal Performance and ROS-Related Functions
808 nm激光下HACCR悬液升温与浓度及功率密度正相关，光热转换效率η=38.2%，5次循环性能稳定。ESR、亚甲蓝降解证实酸性条件下CuMCDs具类芬顿(Fenton-like)催化产•OH能力（中性条件无）；GSH耗竭呈浓度及pH依赖性；催化分解内源性H2 O2 产O2 呈浓度及pH依赖性，可缓解TME缺氧。
2.5. In Vitro Tumor Cell Targeting and Functional Evaluation
CLSM显示HACCR被CD44高表达CT26细胞时间依赖性摄取，游离HA竞争抑制摄取证实CD44介导；与线粒体探针MitoTracker Green共定位Pearson系数达0.933，证实CuMCDs固有线粒体靶向。CCK-8及活/死染色显示浓度依赖性杀瘤效应，808 nm激光显著增敏，铜螯合剂四硫钼酸盐(Tetrathiomolybdate, TTM)可逆转细胞毒性，同等Cu浓度下HACCR优于CuSO4 。HACCR升高胞内ROS及O2 水平，下调HIF-1α(Hypoxia-Inducible Factor-1α)、VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)及PD-L1(Programmed Death-Ligand 1)蛋白表达。
2.6. Mechanism Verification of HACCR-Induced Cuproptosis
HACCR处理使胞内Cu(I)浓度升高，激光增强；WB及免疫荧光显示铜死亡负调控蛋白FDX1(Ferredoxin 1)与LIAS(Lipoic Acid Synthase)下调，DLAT(Dihydrolipoamide Acetyltransferase，脂酰化蛋白标志)聚集典型，TTM预处理可逆转上述变化排除铁/二硫化物死亡干扰。JC-1染色示ΔΨm下降（红↓绿↑），TTM可保护；胞内GSH↓，TCA循环中间产物丙酮酸及α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)升高，符合铜死亡代谢特征；裂解Caspase-3上调为线粒体损伤继发而非主导凋亡途径，ATP7A(Copper-transporting ATPase)下调。
2.7. In Vitro ICD Induction and Immune Cell Regulation
HACCR±Laser上调CRT(Calreticulin)与HMGB1(High Mobility Group Box 1)表面/胞外释放及胞外ATP，证实ICD。共培养实验中HACCR处理CT26上清促DC2.4细胞CD80/CD86成熟率高于LPS阳性对照；促Raw264.7巨噬细胞CD86↑/CD206↓即M2→M1极化；DC与巨噬细胞分泌促炎因子IL-6、TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)升高，抑炎IL-10降低。
2.8. In Vivo Tumor Targeting and Photothermal Performance
小鼠活体荧光成像示HACCR静脉给药后8 h肿瘤部位荧光最强并持续至48 h，离体脏器证实肿瘤富集显著高于正常组织（CD44+EPR双重机制）。红外热成像示瘤区8 h时808 nm激光照射温升最大，适于引导光热治疗。
2.9. In Vivo Antitumor Efficacy Evaluation
双侧CT26模型分组：Saline、αPD-L1单药、HACCR、HACCR+Laser、HACCR+Laser+αPD-L1。原发瘤抑制率分别为—、4.82%、54.22%、72.29%、80.72%；远端瘤抑制率为—、3.66%、24.39%、51.22%、62.20%。仅三联组显著抑制远端未照射肿瘤，提示系统性抗肿瘤免疫建立；各期间体重无波动。缺Laser+αPD-L1对照组及游离组分单药组待后续补充。
2.10. In Vivo Biosafety Evaluation
主要脏器H&E未见炎性坏死，脑组织无神经毒性；血生化肝肾功能指标及血常规均在正常范围；ICP-MS示铜经粪便逐步排出，无长期蓄积。
2.11. In Vivo Immune Regulation Mechanism
瘤组织WB示HACCR+Laser组CRT/HMGB1/IL-2↑、HIF-1α/VEGF/PD-L1↓。引流淋巴结DC成熟比例升高；瘤内M1型巨噬细胞↑、M2型↓；CD4+ 及CD8+ CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)浸润显著增加；瘤组织匀浆IL-6/TNF-α/IFN-γ(Interferon-γ)↑、IL-10↓，证实TME免疫抑制被重塑为促炎抗肿瘤状态。
讨论与结论翻译
研究人员构建了含铜-二甲双胍碳点(CuMCDs)无载体自组装、HA-CA pH响应包封的HACCR纳米诊疗平台，CuMCDs具固有线粒体靶向性可将铜精准递送至铜死亡起始位点，整合肿瘤靶向、刺激响应释药、808 nm光热转换、类芬顿化学动力学及免疫调节功能。光热效应强化铜死亡激活、CDT性能及ICD诱导。系统评价证实HACCR高效诱导肿瘤区铜依赖性细胞死亡，重塑免疫抑制TME并促进效应免疫细胞活化与浸润，联用免疫检查点阻断可同时控制原发与远端肿瘤生长且生物安全性良好。该工作为铜死亡基协同癌症治疗建立了集成策略，拓展了刺激响应型纳米药物在肿瘤诊疗中的发展，并为铜依赖性细胞死亡途径的临床转化提供了参考。
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